摘要背景：干细胞因其可向神经元样细胞诱导分化而在临床神经损伤疾病治疗中具有广阔的前景，但干细胞向神经元样细胞诱导分化的效率不高，为此作者对传统的诱导方法进行了改良。目的：探讨 2 种不同方法诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的潜能及 2 种诱导方法的优劣。方法：采用组织块法分离培养人脐带间充质干细胞，显微镜下观察其形态并利用流式细胞仪进行干细胞鉴定，在神经营养因子诱导方案下，采用相同的诱导剂(2% B27、20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 表皮生长因子)，2 种不同的诱导方法将其向神经元样细胞诱导分化(传统方法：将 B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及青链霉素合剂加入 DMEM/F12 培养基中进行诱导，3 d 后加入全反式维甲酸，共培养 10 d;改良方法：将 B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、青链霉素合剂及胎牛血清加入 DMEM/F12 培养基中进行诱导，6 d 后用胰酶消化后重新接种于共聚焦小皿内，次日去除 B27 和胎牛血清，并加入全反式维甲酸，共培养 14 d)。应用免疫荧光染色对诱导分化后细胞表面神经标志物——神经丝蛋白(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行检测，比较 2 种方法诱导后细胞表面神经标志物的阳性表达率。结果与结论：①成功分离出人脐带间充质干细胞，经流式细胞仪鉴定其高表达 CD29、CD105，低表达 CD34、 CD45，符合干细胞特性;②2 种方法诱导后，镜下观察到的细胞均可呈现神经细胞样改变，免疫荧光检测提示 2 种方法诱导后细胞中神经丝蛋白与胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达;③传统方法组神经丝蛋白与胶质纤维酸性蛋白的阳性率分别为 18.73%和 18.01%，改良方法组二者的阳性率分别为 27.48%和 29.24%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05);④结果表明，2 种诱导方法均可将人脐带间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞;但在诱导分化后的细胞形态、神经标志物(神经丝蛋白与胶质纤维酸性蛋白)的阳性表达率方面，改良方法更具有优势。
关键词：人脐带间充质干细胞;诱导分化;神经细胞;神经丝蛋白;胶质纤维酸性蛋白;干细胞
0 引言 Introduction
间充质干细胞是来源于中胚层的非造血干细胞，其具有强大的自我更新、多向分化与免疫调节能力，已成为一种理想的种子细胞，并得到广泛应用[1-4]。间充质干细胞广泛存在于身体的各种组织，易于分离和体外扩增，已能在骨髓、滑膜、羊膜、脐带、胎盘、脐血、脂肪、肺脏、肝脏等组织中被提取出[5-6]。目前已有研究证实人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells， HUMSCs)能够分化为生殖细胞[7]、汗腺细胞[8]、前列腺样上皮细胞[9]、心肌细胞[10]、视网膜前体细胞[11]、肝细胞[12]、胰岛素分泌细胞[13]、内皮细胞[14]、神经组织[15]、软骨组织等多种细胞和组织[16]。HUMSCs的培养具有取材方便、不违背伦理道德和法律要求等优点[17]。此外，还有研究表明脐带中干细胞的含量较骨髓高，故HUMSCs被广泛认可为替代骨髓间充质干细胞的最理想来源[18]。目前，将HUMSCs 诱导分化为神经元样细胞，在治疗神经退行性疾病、神经损伤、脑卒中等神经系统疾病中都取得了进展[19-22]。
课题组前期实验采用了神经营养因子诱导法对 HUMSCs向神经元样细胞诱导分化进行了初探，应用含2% B27、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子的DMEM/F12培养基对HUMSCs进行诱导，免疫荧光检测其表达神经干细胞特异性标志蛋白nestin[23]。前期实验中作者发现HUMSCs向神经元样细胞诱导分化的效率较低，为了探索一种安全、高效的诱导方法以满足以后科研及临床的需要，作者对前期的诱导方法进行了改良，采用相同的诱导剂，对部分诱导剂的添加时间以及应用时间进行了调整，取得了一定的成效。另外，前期实验仅检测了nestin蛋白，为进一步明确诱导HUMSCs分化后的细胞是否为更加成熟的神经元细胞，作者在此次实验中选用了常用的神经标志物—神经丝蛋白(neurofilament protein， NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(glial fiber acidic protein， GFAP)作为检测指标，旨在探索一种更高效的诱导分化方法，并对HUMSCs向神经元样细胞分化的潜能进行初步探讨。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点 实验于2014年5月至2015年6月在新疆医科大学第一附属医院干细胞室及分子生物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 脐带 由新疆医科大学第五附属医院产科获得足月分娩的健康新生儿脐带，经医院伦理委员会审查通过，经产妇及家属同意并签署知情同意书，将其放入装有无菌生理盐水的50 mL离心管内，4 h内处理。
1.3.2 实验设备 倒置荧光显微镜、Leica Logo型荧光显微镜及成像系统(德国Leica公司);流式细胞仪(美国 Beckman公司);含有体积分数为5%CO2培养箱(HF420) (力新仪器上海有限公司)。
1.3.3 实验试剂 0.25%胰蛋白酶溶液和胎牛血清 (Hyclone公司);青链霉素合剂(Sigma公司);FITC标记的抗人CD105、CD29、CD45和CD34抗体(BD公司);表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(PeproTech公司); B27、DMEM/F12(Gibco公司);小鼠抗NF-M多克隆抗体 (H，M，R)(Cell Signaling公司);小鼠抗GFAP多克隆抗体 (BD公司);山羊抗小鼠IgG二抗(Alexa Flour 488)(Abcam 公司);40 g/L多聚甲醛(上海生工公司);Hoechst33342、 TritonX-100、全反式维甲酸(Sigma公司);体积分数为10% 山羊血清(GIBCO公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 HUMSCs的分离培养 采集足月分娩的健康胎儿脐带，用0.1 mol/L PBS充分冲洗，去掉残留血液。采用组织块法培养[23]：剔除脐带内动静脉血管(1根脐静脉，2根脐动脉)，将剩余间质剪成大小约1 mm3 的组织块，均匀地放置在盛有DMEM培养基的培养皿(55 mm)中，然后加入2 mL 胎牛血清固定组织块。2 h后，按比例将含有青链霉素、维生素C、谷氨酰胺及碳酸氢钠的试剂约8 mL加入低糖 DMEM培养基内，放置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中进行培养。间隔3 d给予半量换液，镜下观察贴壁组织块周围的细胞生长情况。当细胞生长达到80%-90%汇合度时，采用0.25%胰酶消化并传代，将组织块移至另一个新的培养皿中，按照上述方法继续进行培养。
1.4.2 流式细胞仪检测细胞表面分子标志物 收集第3代 HUMSCs，经胰酶消化后离心(1 200 r/min×5 min)使细胞重悬，调整细胞浓度为1×106 L-1，分别加入各种流式抗体： CD105、CD29、CD34、CD45等，常温下孵育30 min， 0.1 mol/L PBS冲洗数次后，将其与FITC标记(或PE)的二抗在避光条件下作用30 min，PBS充分洗涤后立即送检。
1.4.3 HUMSCs诱导分化为神经元样细胞 取第3代 HUMSCs，以4 000/cm2 接种在直径为3 cm的小皿内。按如下2种方法进行HUMSCs向神经元样细胞的诱导分化。 ①诱导法一(前期实验的诱导方法)：将2% B27、20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子及青链霉素合剂加入DMEM/F12培养基中进行诱导，3 d后加入 0.5 μmol/L全反式维甲酸，隔日换液，10 d后在光学显微镜下观察诱导分化后的细胞形态;②诱导法二(改良的诱导方法)：将2% B27、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 表皮生长因子、青链霉素合剂及体积分数为2%胎牛血清加入DMEM/F12培养基中进行诱导，6 d后用胰酶消化，以 4 000/cm2 传代，接种于直径为3 cm的共聚焦小皿内，次日用0.1 mol/L PBS清洗去除小皿内2% B27和胎牛血清，并加入浓度为0.5 μmol/L全反式维甲酸，隔日半量换液1次， 14 d后在光学显微镜下观察诱导分化后的细胞形态。
1.5 主要观察指标 诱导分化后免疫荧光染色检测 NF-M、GFAP的表达：使用40 g/L多聚甲醛对诱导分化后的细胞予以固定，山羊血清封闭，分别加入NF-M抗体 (1∶500)和GFAP抗体(1∶500)并在4 ℃下孵育过夜， 0.1 mol/L PBS洗涤后加入山羊抗鼠二抗(1∶100)于室温孵育60 min，0.1 mol/L PBS洗涤后Hoechst3342(0.5 mg/L) 复染细胞核，Leica倒置荧光显微镜观察，应用共聚焦显微镜进行拍照。重复实验至少3次以上，每次分别采集共聚焦图片15张(放大250倍)，采用Image-Pro Plus6.0图像处理分析软件分别计算2种方法诱导后的阳性细胞百分数，以计量资料形式表示。2种方法分别设阴性对照(未加入NF-M及 GFAP)，应用免疫荧光法检测其细胞标志物NF-M、GFAP 的表达。
1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，因资料不符合正态性，故采用秩和检验，检验水准α=0.05， P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 HUMSCs形态 原代培养第3天，倒置荧光显微镜观察可见组织块外周有散在的细胞游出。培养第5-7天，大量细胞由组织块中爬出，贴在皿底，呈长梭状，类似于成纤维细胞，汇聚后细胞排列紧密，呈群落样生长，聚合的细胞呈漩涡状。组织块法培养原代细胞达90%-95%融合的时间为14-16 d，可进行传代培养，见图1。传代数小时后 HUMSCs快速贴壁，3-5 d后细胞可再次达到80%-90%的汇合度。经过数代培养后，细胞形状无明显变化，增殖能力无明显变化。
2.2 HUMSCs表型鉴定结果 流式细胞仪检测结果显示 CD34、CD45表达为阴性，而CD29和CD105表达为阳性(阳性率分别为35.3%和95.9%)，符合HUMSCs的特征性标记物表达，见图2，提示组织块法培养可获得HUMSCs。
2.3 诱导HUMSCs分化为神经元样细胞 HUMSCs通过 2种方法诱导后均可分化成为神经元样细胞，部分细胞形态发生变化、胞体收缩形成突起呈星形，细胞之间网状连接，形态与神经元或神经胶质细胞近似。细胞生长状态良好，可存活时间较长，改良方案诱导分化后的细胞形态学变化尤为明显，细胞之间相互联系的神经微丝结构明显增多，明显优于前期实验的诱导方法，见图3。
2.4 免疫荧光染色检测诱导分化后细胞NF-M、GFAP的表达 免疫荧光染色提示HUMSCs用2种方法诱导后均可见 NF-M和GFAP呈阳性表达，表明诱导分化后的细胞具有神经细胞的功能活性，见图4，5。
2.5 免疫荧光定量NF-M与GFAP阳性表达 传统方法组 NF-M和GFAP的阳性表达率分别为18.73%和18.01%;改良方法组NF-M和GFAP的阳性表达率分别为27.48%和 29.24%，后者明显优于前者，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。
3 讨论 Discussion
HUMSCs最早由McElreavey等[24]于1991年在脐带华尔通氏胶的黏液结缔组织中分离获得，因其培养取材方便、免疫原性低，并且在体外有较强的自我增殖与多向分化潜能等特点，已经成为种子细胞的理想来源，其在细胞移植、组织工程材料、基因靶向治疗等方面具有广泛的临床应用价值[17]。
间充质干细胞的分离方法有贴壁培养法、胰酶或胶原酶消化法、免疫磁珠法、流式细胞仪分选法、密度梯度离心法等多种，但目前尚无一种完美的方法，通常需要多种方法结合起来。课题组前期采用组织块法和胰酶冷消化法体外培养HUMSCs进行实验研究，结果表明组织块法培养出的HUMSCs形态保持良好的长梭形，而且增殖率快，可作为获取充足数量干细胞的理想培养方法[23]。考虑到胰酶或胶原酶消化法容易对细胞造成损伤，流式细胞仪分选法成本高、操作复杂、实验条件要求高，此次研究中HUMSCs 的培养仍采用成本低廉、操作简单、对细胞损伤小的组织块贴壁培养法。该研究对组织块法分离培养的HUMSCs表面标志物进行流式细胞仪检测，结果表明CD29、CD105高表达(分别为35.3%和95.9%，且CD105表达大于95%)，而 CD34、CD45低表达，故其具有干细胞的显著特征;课题组前期实验将HUMSCs培养传代数次后观察其仍具有很强的增殖能力，并通过EdU标记证实其具有增殖功能活性[25]，这与既往报道的骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞及胎盘间充质干细胞的生物学特性相似[26-28]。
近年来，间充质干细胞在骨、软骨、脊髓损伤及多发性硬化、克罗恩病等疾病的临床研究中愈来愈受重视[29]，目前HUMSCs已用于临床2型糖尿病[30]、重度收缩性心力衰竭等疾病的治疗[31]。干细胞对神经系统损伤和修复一直是临床关注的焦点[19-22]，研究发现间充质干细胞能分泌多种免疫调节因子和神经营养因子，可促进受损部位的神经再生，安全有效地改善了神经系统疾病的预后，其临床疗效已在脑瘫、帕金森病、脊髓变性疾病、脑血管疾病等临床试验中得到验证[32]。目前认为HUMSCs修复外周神经系统受损的关键机制为其旁分泌作用[33]，也有学者认为 HUMSCs可以通过白细胞介素8介导的分泌机制促进受损的神经功能恢复[34]。
当前，体外诱导HUMSCs向神经元样细胞分化的方式包括化学法、中药、神经营养因子法、共培养法，还有学者利用脑脊液等进行诱导分化的方法[35]。化学因子诱导的细胞存活时间短[36]，且其诱导的神经元样细胞的特征性形态学变化表明其具有细胞毒性作用，可能不适用体内移植。中药可诱导HUMSCs分化为神经元样细胞，但是中药发挥诱导分化的作用机制尚需更近一步研究。而神经营养因子诱导剂为生物制剂，对细胞损伤小，安全性相对较高，为目前广泛应用的经典诱导方法。
基于前期HUMSCs培养及其生物学特性观察的实验研究基础[23，25]，该实验采用同样的诱导剂，2种不同的诱导方法将HUMSCs向神经元样细胞诱导分化，并对2种诱导方法进行了评价和比较。作者经过多次重复实验证实了2 种方法诱导后细胞的形态均呈神经细胞样改变，免疫荧光化学检测NF-M及GFAP均呈阳性表达，同时，在进行NF-M 及GFAP免疫荧光染色时分别设置了PBS阴性对照组，除外免疫荧光假阳性的可能，故实验证实了HUMSCs具有向神经元样细胞分化的潜能。通过镜下观察及统计学分析发现改良方法的细胞形态改变及神经细胞标志物(NF-M和 GFAP)的阳性率明显优于传统方法，故改良方法是对前期诱导方法的有效改良。此结论可为后续HUMSCs向神经元样细胞诱导分化提供理论支持。
该实验2种诱导方法的主要不同之处在于改良方法的试剂中含有体积分数为2%的胎牛血清以及2种诱导法应用 B27的时间长短不同。改良方法中体积分数为2%的胎牛血清在实验早期有助于促进细胞贴壁生长，为HUMSCs向神经元样细胞分化提供了充足的营养物质，在7 d后及时去除胎牛血清，B27又可以减缓细胞生长，避免细胞生长过快、浓度过大而影响干细胞向神经元样细胞分化过程中的形态变化及免疫荧光染色效果。传统方法的试剂中虽然不含积分数为2%的胎牛血清但含有B27，且在其诱导后期继续应用B27总共诱导了10 d，其诱导后的细胞生长旺盛，但呈神经细胞样形态变化的细胞较少，免疫荧光染色中NF-M和 GFAP的阳性表达率也较低。孙丽等[37]采用丹参联合生长因子诱导HUMSCs向神经元样细胞分化后的GFAP阳性表达率为(25.6±2.6)%，与此实验结果类似，但其未检测 NF-M;郜元军等[38]比较了胶质细胞神经营养因子联合胎肠培养基，维甲酸、ZnSO4联合胎肠培养基诱导大鼠基质干细胞分化为肠神经细胞的效率，2种诱导法NF-M的阳性表达率分别为(75.6±8.4)%和(48.5±7.5)%，而GFAP均为阴性表达。郜元军实验中NF-M的阳性率高于此次实验研究，考虑与两者的实验对象、所用的诱导方法及试剂不同有关。此次实验过程中传统诱导方法在第10天左右细胞形态最佳，此后出现大量细胞凋亡现象;而改良诱导方法在第14 天左右细胞形态最佳，仅出现少量细胞凋亡现象，所以传统诱导法的周期设定为10 d，而改良诱导方法为14 d，两者没能达到统一的诱导时间。
实验结果验证了HUMSCs可分化为神经元样细胞，作者通过对前期的诱导方法进行改良，明显提高了HUMSCs 向神经元样细胞诱导分化的效率，为后续实验研究提供了有力的保障。但是研究也存在不足之处有待改进，目前常用神经标志物有神经特异性烯醇化酶、NF-M、GFAP、β微管蛋白Ⅲ、微管相关蛋白等。该研究为系列探索性实验研究，前期实验检测了神经干细胞特异性标志蛋白nestin，此次研究仅选用了神经标志物NF-M和GFAP作为检测指标，说服力仍显不足，后续研究中课题组还将进一步检测微管相关蛋白、β微管蛋白Ⅲ等神经标志物以验证实验结果。
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