摘 要：利用 Suzuki 反应制备得到三苯胺三吡啶(TPPA)，通过季铵盐成盐反应制备得到超分子荧光探针(TPPA-DBB). 通过核磁质谱仪、红外光谱仪、紫外-可见光度计、荧光光谱仪、动态光散射测试仪和激光共聚焦显微镜等对产物进行表征. 结果表明：TPPA-DBB 超分子荧光探针表现出很好的聚集诱导荧光性质(AIE)和长斯托克位移. 细胞成像结果显示：TPPA-DBB 超分子荧光探针是一种与 DNA 强力结合的荧光染料，并且具有很好的生物相容性.
关键词：聚集诱导荧光;三苯胺;细胞成像;超分子
0 引言
近年来荧光成像技术作为快速发展的医学诊疗技术而受到广泛的关注，而高质量的细胞成像技术更需要具有生物相容性、亮度、稳定性好的有机外源造影剂[1，2]. 2001 年被发现并迅速发展的聚集诱导发光材料(AIEgens)是优秀的候选材料，因为它们在抑制分子内运动效应时表现出荧光增强的效果. 一旦与生物分子结合或受到周围生物环境影响，AIEgens 就会被单独点亮并且可以在高灵敏度荧光成像的基础上获取丰富的信息[3-7]. 近年来市面上有一些商品化的细胞核荧光染料，比如 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，它们只会发出蓝色荧光[8-11]，这可能会导致细胞损伤显著的细胞自发荧光，更何况价格昂贵且不稳定[12]. 通过 Suzuki 反应和季铵盐反应合成了含三苯胺吡啶基团的超分子探针(TPPA-DBB). 通过荧光和紫外光谱的研究，以期其具备作为细胞成像荧光探针光学特质. 同时通过荧光显微镜和细胞毒性测试来研究该荧光超分子探针在活体细胞中的成像特征和生物相容性.
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
三碘代三苯胺(分析纯，安耐吉化学)，4-吡啶硼酸(分析纯，安耐吉化学)，四三苯基磷钯(分析纯，阿拉丁试剂)，1，4-二(溴甲基)苯(分析纯，阿拉丁试剂)，碳酸钾，四氢呋喃，正己烷，石油醚等试剂均为分析纯. MERCURY 核磁质谱仪;Nicolet AVATAR 360 TF-IR 红外光谱仪;日本 UV-2550 紫外-可见分光光度计;美国 PE 公司 LS-55 荧光仪;日本 OLYMPUS FV1200 激光共聚焦显微镜;Zetasizer Nano ZS 动态光散射测试仪.
1.2 合成
1.2.1 三苯胺三吡啶的合成
取三碘代三苯胺 311.5 mg(0.5 mmol)溶于 40 mL 无水四氢呋喃中. 取 4-吡啶硼酸 400.5 mg(2.25 mmol)溶于 40 mL 甲醇中并添加 57.8 mg(0.05 mmol)四三苯基磷钯和 310 mg(2.25 mmol)碳酸钾于三口瓶中搅拌 0.5 h，完成后将三碘代三苯胺四氢呋喃溶液加入三口瓶中，在氮气保护下于 120 ℃回流 24 h. 得到的产物三苯胺三吡啶(TPPA)为淡黄色固体.
1.2.2 超分子荧光探针的合成
将干燥的 TPPA 固体 150 mg(0.31 mmol)溶于 50 mL 无水四氢呋喃中，在不断搅拌下缓慢滴加对二苄溴 36.75 mg(0.21 mmol). 滴加完成后，通氮气保护并在 120 ℃条件下回流 2 h. 反应完成后将反应物用刮刀刮下并用甲醇重结晶并反复冲洗浸泡. 最后得到的产物超分子荧光探针(TPPA-DBB)为橙红色固体. TPPA-DBB 的化学结构如图 1 所示.
1.3 表征与测试
1.3.1 紫外光谱测试
将配制好的不同浓度的溶液放入超声波清洗仪中振荡均匀 0.5 h，并转入 2 cm 光程的石英比色皿. 待紫外光谱仪稳定后通过波长扫描模式测试最大吸收波长和最大吸收强度.
1.3.2 荧光光谱测试
将配制好的不同浓度的溶液放入超声波清洗仪中振荡均匀 0.5 h，并转入 2 cm 光程的石英比色皿. 待荧光光谱仪稳定后通过波长扫描模式确定荧光探针的激发波长，并以此激发波长测试最大荧光发射波长及荧光发射强度.
1.3.3 DNA 体外识别测试
配制 1 g/L 的 TPPA-DBB 溶液，然后分别称取 0.06～8.00 mg 系列不同质量的DNA 分子溶于 TPPA-DBB 水溶液中，之后将这些溶液放入超声波清洗机中超声 10 min 使其混合均匀，待冷却至室温后进行荧光光谱的测定.
1.3.4 细胞毒性测试
选择 A549 细胞为研究对象，采用 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT) 法检测 TPPA-DBB 的细胞毒性. 将对数期的 A549 细胞种于 96 孔培养板中(接种密度为 1×104 /孔)，放入 37 ℃、5% CO2 条件的培养箱里培养 24 h，然后将含有不同浓度的 TPPA-DBB 溶液分别依次滴加至不同孔中. TPPADBB 的浓度依次为 0，10，20，30，40，50 μM，在 5%CO2、37 ℃的条件下孵育 24 h. 向每个孔中加入 MTT 溶液 10 μL(5 g/L)，再以相同条件继续孵育 2 h. 最后在每个小孔中加入 100 μL 二甲基亚砜并室温静置 2 h. 用荧光免疫分析仪检测690 nm 处各孔的吸光度，检测荧光探针的细胞毒性. 最后实验结果由 7 组实验平均值和标准偏差得出.
1.3.5 细胞成像测试
将人肺癌细胞(A549)接种(接种密度为 1×105 /孔)在 15 mm 载玻片上贴壁生长 24 h，然后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗，然后将浓度为 20 mg/L 的 TPPA-DBB 用二甲基亚砜稀释并滴加在载玻片中，并继续孵育10 min，继而用 PBS 缓冲液洗涤. 最后将制备好的细胞载玻片放置在激光共聚焦荧光显微镜下观察并记录.
2 结果与讨论
2.1 TPPA-DBB 固体紫外和固体荧光测试
取 TPPA-DBB 的固体进行紫外和荧光光谱测试，如图 2 所示，固体最大紫外吸收峰为 438 nm，固体荧光发射最大波长为 613 nm. 计算 TPPA-DBB 共聚物的斯托克位移为 175 nm. 根据紫外和荧光光谱测试结果可以得出 TPPA-DBB 具有长斯托克位移. 通常具有长斯托克位移的物质具有背景干扰低、样品穿透性强、检测灵敏度高等优点.
2.2 TPPA-DBB 在甲醇中的紫外光谱
选择 TPPA-DBB 浓度范围从 1.0 mg/L 到 12.0 mg/L 的甲醇溶液测试紫外可见吸收光谱. 如图 3 所示，图中随着 TPPA-DBB 质量浓度逐渐增大，紫外吸光度也逐渐增大. 从紫外光谱来看紫外吸收峰形没有发生改变，而且最大吸收峰没有发生转移，说明 TPPA-DBB 在甲醇溶液中没有发生分子间相互作用. 分析表明 TPPA-DBB 在甲醇溶液中具有很好的稳定性.
2.3 聚集诱导荧光特性
选取溶解性良好的溶剂甲醇和不良好的溶剂水作为混合溶剂体系. 通过检测 TPPA-DBB 在水和甲醇不同体积比溶液中的荧光光谱，发现 TPPA-DBB 具有聚集诱导荧光特性，如图 4～图 6 所示，水的体积分数在 0%～20%范围时荧光变化并不明显，而在水的体积分数为 20%～60%的范围内有明显的荧光增强现象，水的体积分数在 60%～95%的范围时虽然荧光强度增加但是增加速率变小. 最终检验荧光强度倍数提高，最大荧光强度大约增加 2 倍. 这说明 TPPA-DBB 超分子荧光探针具有聚集诱导荧光特性.
2.4 DNA 体外识别
测试测试 TPPA-DBB 超分子是否也具有对 DNA 荧光识别作用，首先采取体外实验的办法进行确定. 发现 TPPA-DBB 与 DNA 结合后最大荧光发射波长发生了蓝移，这说明 TPPA-DBB 可以通过分子间作用力与DNA 分子进行结合，见图 7 和图 8. 在 DNA 低浓度范围(0.06～1.00 mg)内加入 DNA 的质量与荧光发射强度成正比，当加入 DNA 的质量超过 4 mg 时发生饱和.
2.5 细胞毒性测试
以人体肺腺癌细胞 A549 细胞为实验对象，分别对不同浓度的 TPPA-DBB 探针做了 MTT 实验. 如图 9(a)所示，细胞的存活率随着 TPPA-DBB 探针浓度的增大而降低，最终细胞的存活度都在 80%以上，表明化合物 TPPA-DBB 的加入对细胞的毒性伤害较小. 在探针的浓度为 10 mg/L 的条件下，细胞存活度与空白对比只有很小的损失，当探针浓度为 20 mg/L 时细胞仍具有 90%以上存活率. 以 10 mg/L 作为工作浓度考察了细胞代际存活率，见图 9(b)，细胞在培养 5 代时仍有 80%的存活率.
2.6 细胞成像测试
使用激光共聚焦荧光显微镜进行细胞成像的测试，结果如图 10 所示，通过与 DAPI 做比对实验观察， TPPA-DBB 最终停留在细胞核内部并对细胞核进行特定标记. 这说明合成的 TPPA-DBB 超分子荧光探针可以很好地穿越细胞膜进入细胞体内，并且通过细胞核的核孔进入到细胞核内部与 DNA 结合发出明亮的荧光. 在单色激发波长下，可以很明显地捕捉到荧光探针在细胞核内驻留并且可以发出很强的荧光. 上述结果说明 TPPA-DBB 是一种可以对细胞核染色的高灵敏度的超分子荧光探针.
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3 结论
通过 Suzuki 偶联反应和季铵盐反应制备了具有三苯胺三吡啶基团的超分子荧光探针 TPPA-DBB. TPPA-DBB 超分子在混合溶液中表现出聚集诱导荧光性质，其固体也有很大的斯托克位移. TPPA-DBB 分子稳定性好、易穿透细胞膜、细胞毒性低. 作为超分子荧光探针可以有效地提高自身的电荷密度，大幅度提高与DNA 的相互作用，与传统的小分子荧光探针相比具有更高的灵敏度和更好的生物相容性. 在细胞成像领域中 TPPA-DBB 可以实现对 A549 活细胞的细胞核进行高灵敏度、高分辨率的成像.
