摘 要 桑树因具有较强的耐水淹特性，近年来成为库区消落带植被恢复的备选树种。 为探讨饲料桑适应水淹胁迫的机理，以 2 年生盆栽饲料桑苗为对象，采取室内模拟水淹的方法，研究不同水淹时间和深度下桑苗叶片形态以及叶片内无氧呼吸酶(PDC、ADH、LDH)、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的变化。 结果显示：(1)根淹组桑苗在水淹期间叶片受害程度较轻，深淹组桑苗叶片在水淹 15 d 即出现萎蔫和黄化，至水淹结束后叶片基本全部腐烂、脱落。 但深淹组桑苗在水淹 75 d 后仍能萌发新芽，且浅淹组部分植株恢复生长状况良好。 (2)相同水淹时间下，桑苗叶片内无氧呼吸酶和抗氧化酶活性随水淹深度的增加均呈现显著的上升趋势(P<0.05)。 (3)桑苗叶片 SOD 酶活性在水淹 60 d 显著上升，对照组和根淹组在水淹90 d分别降低了 3.49%和 9.22%，而 POD 和 CAT 酶活性在水淹 90 d 达到最大值，3 组处理下 2 种酶活性分别比水淹 30 d 增加了 8.03%、15.70%、10.23%和 12.05%、6.45%、9.15%，差异显著(P<0.05)。 提高叶片无氧呼吸酶活性、增强 3 种抗氧化酶相互协调作用是桑苗水淹胁迫下的响应机制。 综上，饲料桑苗具有良好的适应水淹胁迫能力，可作为三峡库区消落带植被恢复的备选树种。
关键词 饲料桑; 水淹胁迫; 叶片; 酶活性; 三峡库区消落带
消落带是由水库周期性蓄水形成的水位涨落区域，该区长期受到水、浪冲淘，原有土壤、植被条件遭受严重破坏，水土流失严重，是生境极其脆弱的过渡带。 在水库消落带进行植被恢复是改善消落带生态环境的重要途径(卢刚等，2016)。 由于三峡水库反季节周期性蓄水的特点，消落带耐淹植物的筛选一直是该区生态修复的关键。 当前已经开展了较多关于耐淹植物筛选以及植物耐涝生理机制等方面的研究。 例如，研究发现，夏栎(Quercus robur)可在其根皮层和不定根中形成通气组织，具有较强的耐水淹能力(Parent et al.，2011);两年生栗叶栎(Q. casta⁃ neifolia)通过关闭叶片气孔以防止组织过度脱水、生成不定根和茎皮孔以改善根系内部气体交换等形态调节，可在水淹 60 d 后全部存活下来(Parad et al.，2016);秋华柳(Salix variegata)通过形成不定根、提高酶活性以降低活性氧的伤害(陈芳清等，2008)，在长达 90 d 的水淹胁迫下存活率达 100%，且表现出较强的光合和生长适应性(罗芳丽等，2007);中华蚊母树(Distylium chinense)通过形成不定根、减少叶片数量等形态调整，增强自身耐水淹能力(刘泽彬等，2014)，在秋、冬季模拟水淹条件下苗木存活率达 100%(Liu et al.，2014);疏花水柏枝(Myricarialaxiflora)可通过自身休眠保证其生理活性不受到夏季水淹的影响(陈芳清等，2009)，并在部分水淹条件下能存活 150 d 以上(Yang et al.，2014);狗牙根(Cynodon dactylon)通过抑制自身的生长，降低可溶性糖、淀粉等碳水化合物的消耗(李秋华等，2013)，在水深 5 ～ 25 m、水淹胁迫 7 个月后存活率高达100%(刘送平等，2013);双穗雀稗(Paspalum disti⁃ chum)、空心莲子草( Alternanthera philoxeroides)、扁穗牛鞭草( Hemarthria compressa)、香附子( Cyperusrotundus)等草本植物可通过自身茎的伸长生长突破没顶水淹(王海锋等，2008;徐少君等，2008;刘送平等，2013)，具有很强的耐水淹性;香根草( Vetiveriazizanioides)通过停滞地上部分的生长以适应水淹环境，在没顶淹没 180 d 后存活率为87.5%(王海锋等，2008);宽叶独行菜(Lepidium latifolium)能够在水淹胁迫下存活 50 d，维持较高的光合作用以及根系中可溶性糖的积累是其适应水淹环境的重要途径(Chen et al.，2005)。 此外，还发现野地瓜藤(Ficustikoua)、苏丹草( Sorghum sudanense) 等可以作为消落带植被恢复的备选物种(马利民等，2009)。 然而，这些研究大部分集中在耐淹草本和灌木的筛选上，对耐淹树种的筛选研究则非常缺乏。
桑树( Morus alba) 是桑科桑属落叶乔木或灌木，喜温暖湿润气候，耐干旱、水湿能力极强。 通过野外实地调查发现，根系发达的多年生桑树在水深13.2 m、水淹胁迫 214 d 后，仍能存活并发芽展叶，形成新的树冠(张建军等，2012);通过室内模拟水淹试验发现，1 年生饲料桑苗可以很好的适应根淹胁迫，适合生长在较高海拔的水库消落带(徐子棋等，2015);作为三峡库区消落带植被恢复的备选树种，桑树可通过增加侧根数量适应水淹胁迫的低氧环境(李佳杏等，2012);在 2010—2013 年对三峡库区消落带原有桑树的存活情况与利用现状的调查中发现，海拔在 172 ～ 175 m 桑苗的整株成活率达 87%(黄先智等，2012);幼树期饲料桑在完全淹没的情况，能存活 50 d 左右、淹没深度在 1 m 以上时，可存活 30 d 左右(孔琼菊等，2013);此外，研究发现，在三峡库区消落带种植桑树可以增强林地土壤的抗蚀性，对库区消落带生态修复有重要意义(郭天雷等，2015)。 本文以 2 年生盆栽饲料桑苗为研究对象，利用室内模拟水淹的方法，研究不同水淹时间和水淹深度下桑苗叶片形态以及部分酶活性的变化情况，以期从生理生态的角度揭示 2 年生饲料桑苗对水淹胁迫的适应机制，为三峡库区消落带耐淹树种的筛选和生境的修复提供理论依据。
1 材料与方法
1 1 材料
试验材料取自重庆市开县渠口镇大浪坝沧海桑苗基地，为自然生长的 2 年生饲料桑苗，于 2016 年8 月在苗圃将桑苗移栽到内径 29 cm、高 23 cm 的花盆中(每个花盆中移栽 1 株桑苗)，花盆内土深 12cm、埋根深度 10 cm。 栽植桑苗使用的土壤为氮磷钾酶活性≥6%、有机质≥45%、pH 值为5.5～6.5、有效活菌数≥2×107copies·g-1的育苗基质。 为保证苗木正常生长，予以浇水和管理。 于 2016 年 12 月选择长势良好的桑苗(平均株高为 56.38 cm、平均地径为 8.26 mm)进行水淹胁迫试验。
12 试验设计
根据水淹深度设置 3 组处理，分别是：对照组(CK)、根淹胁迫组(GY)和深淹胁迫组( SY)，每组处理有 10 株桑苗(每组处理选择的桑苗长势基本一致)。 其中，根淹胁迫组和深淹胁迫组放置在水箱内进行水淹胁迫，水箱内的水深分别为 14 和 50cm (即水淹深度超过花盆内土高 2 和 38 cm)，对照组放置在水箱旁光照充足的空地上。 试验过程中保持通风，水淹开始后每 5 d 更换一次水箱内的水、对照组浇水 600 mL。 与此同时，每 5 d 观察水淹胁迫下桑苗的外部形态特征，拍照记录。 水淹胁迫试验于 2017 年 3 月结束，历时 3 个月。 水淹胁迫试验结束后将深淹组和根淹组桑苗重新放置在光照充足的室内，每 5 d 浇水一次，观察并记录其水淹胁迫后的恢复生长情况。
1 3 指标测定
在水淹期间，每 15 d 观测 3 组不同水淹深度处理下桑苗的叶片形态变化情况，包括卷曲或萎蔫的叶片数量、黄叶数量、落叶数量以及产生褐斑或腐烂的叶片数量，详细记录并拍照。
分别于 2017 年 1 月 6 日(水淹 30 d)、2017 年 2月 5 日(水淹 60 d)、2017 年 3 月 7 日(水淹 90 d)进行取样。 取样时选取桑苗植株上完整、新鲜的叶片，剪下后清洗干净并擦干水分，每株桑苗称取不少于300 mg 的叶片样本，装入保鲜袋，保存在冰箱中。测定的指标包括：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶( POD)、 过 氧 化 氢 酶 ( CAT )、 丙 酮 酸 脱 羧 酶(PDC)、乙醇脱氢酶(ADH)和乳酸脱氢酶( LDH)，指标的测定均采取酶联免疫吸附实验(ELISA)，酶活性单位为 U·mL-1。 将样本叶片在冰冷的 PBS中漂洗，滤纸拭干，准确称重，按重量与体积为 1 ∶ 4的比例加入 4 倍体积的匀浆介质于匀浆管中，在冰水浴条件下尽快剪碎样本叶片，进行匀浆。 将制备好的 20%匀浆液用离心机(4000 r·min-1)离心 20min，取上清液。 取板条并设置标准品孔和样本孔：标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μL，样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液 40 μL，空白孔不加。 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体 100 μL，用封板膜封住反应孔，用 37 ℃ 水浴锅水浴 60 min 后弃去液体，用洗板机洗板，每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37 ℃避光孵育 15 min。 最后在每孔中加入终止液 50 μL，于 15 min 内在 450 nm 波长处测定各孔的OD 值。 计算出标准曲线的回归方程，将样品的 OD值代入方程式，计算出样品浓度。 每个样品重复测定 3 次，取平均值。
1.4 分析方法
试验数据分析使用 EXCEL 2010 表格进行整理和绘图，采用 SPSS 17.0 对不同处理的数据进行单因素方差分析(one⁃way ANOVA)，用 Duncan 法进行多重比较(显著性水平为 0.05)。
相关期刊推荐：《生态学杂志》(月刊)是中国科学技术协会主管、中国生态学学会主办、中国科学院沈阳应用生态研究所承办的综合性学术期刊，创刊于1982年，由科学出版社出版。主要刊登生态学领域有创造性，立论科学、正确、充分，有较高学术价值的论文，反映我国生态学的学术水平和发展方向，报道生态学的科研成果与科研进展，跟踪学科发展前沿，促进国内外学术交流与合作。有投稿需求的作者，可以直接与期刊天空在线编辑联系。
2 结果与分析
2 .1 水淹胁迫对桑苗叶片形态的影响
水淹胁迫对2年生桑苗叶片形态的影响见表1、 图 1。 在整个水淹期间，对照组桑苗的叶片形态基本无变化，仅在水淹 60～90 d 出现轻微的落叶现象;水淹胁迫 15 d 后根淹组和深淹组分别有 2 个和 8个叶片边缘变黄，深淹组的 10 个叶片出现轻微的卷曲、萎蔫现象;水淹 30 d 深淹组有 19 个叶片产生褐斑，且落叶现象加剧，根淹组有少量叶片出现卷曲和萎蔫;水淹 60 d 后深淹组出现较为明显的涝害症状，叶片持续萎蔫脱落，且有大量叶片形成褐斑并腐烂;而水淹 75 d 后深淹组的一株桑苗在距水面较近的茎顶处有 2 个新芽萌发;水淹胁迫 90 d 后，深淹组桑苗叶片涝害症状显著，叶片基本全部腐烂、脱落。 水淹胁迫结束后恢复生长 15 d 根淹组和深淹组分别有 3 株和 1 株桑苗开始萌发新芽，且此后 4株桑苗恢复生长状况良好。
2.2 水淹胁迫对桑苗叶片抗氧化酶活性的影响
由图 2 可以看出，在相同的水淹时间下，桑苗叶片 SOD、CAT、POD 酶活性均随水淹深度的增加而显著上升(P<0.05)。 对照组和根淹组 SOD 酶活性随着水淹时间的增加出现先显著增加后下降的趋势，水淹 60 d 达 到 最 大 值， 分 别 比 水 淹 30 d 增 加31.88%和 16.46%，差异显著(P<0.05)，深淹组 SOD酶活性在整个水淹期间呈现出无显著性差异的增长趋势，其在水淹 60 和 90 d 分别比水淹 30 d 增长了5.27%和 5.84%;深淹组和对照组 CAT 酶活性随水淹时间的增加均有所升高，根淹组 CAT 酶活性在水淹 60 d 增加 11.7%，差异显著(P<0.05)，水淹 90 d比 60 d 又降低了 4.7%;根淹组 POD 酶活性随水淹时间的增加显著升高，深淹组 POD 酶活性随水淹时间的增加呈现出先下降后显著增加的趋势，对照组POD 酶活性在水淹 60 d 达到最大值，比水淹 30 d增加了 15.19%，差异显著(P<0.05)，在水淹 90 d 又降低了 6.21%，无显著差异。
2.3 水淹胁迫对叶片无氧呼吸酶活性的影响
由图 3 可以看出，在相同的水淹时间下，随着水淹深度的增加，桑苗叶片 ADH、LDH、PDC 酶活性均呈现出显著的增加趋势(P<0.05)。 且随着水淹时间的增加，3 种水淹深度处理下的 ADH 酶活性均呈现增长趋势，对照组 ADH 酶活性在水淹 60、90 d 分别比 30 d 升高了 17. 07%、 36. 39%，差异显著 ( P<0.05)，根淹组和深淹组 ADH 酶活性在水淹 90 d比水淹 30 d 分别显著增加了 8.9%和 8.25%;深淹组LDH 酶活性在水淹 60 d 有所降低，在水淹 90 d 又升高了 5.94%，差异显著(P<0.05)，根淹组和对照组 LDH 酶活性随着水淹时间的增加均有所升高，根 淹组无显著性差异，对照组在水淹 90 d 比 30 d 增加了 4.83%，差异显著(P<0.05);对照组 PDC 酶活性随水淹时间的增加呈现升高的趋势，在水淹 90 d 比30 d 增加了 9.88%，差异显著(P<0.05)，而根淹组在整个水淹期间无显著差异，深淹组 PDC 酶活性在水淹 60 d 降低了 3.43%，水淹 90 d 又上升了 6.6%，差异显著(P<0.05)。
3 讨 论
3. 1 水淹胁迫下桑苗叶片的形态变化
水淹对植物造成伤害的主要原因是缺氧，缺氧将能量代谢从好氧模式转化为厌氧模式，使植物出现萎蔫现象( Sairam et al.，2008)，且长期无氧呼吸导致植物体内乙醇、乳酸、乙醛等有害物质大量积累，严重威胁植物的生长(李彦杰等，2014)。 研究发现，叶片脱落是阔叶和常绿树种应对水淹环境的一种自我保护机制( Parolin et al.，2010)。 本研究中，3 组处理的桑苗均出现了不同程度的落叶现象，其中深淹组在水淹 30 d 即出现严重的落叶现象，而根淹组在水淹 45 d 才开始落叶，且深淹组的落叶现象在整个水淹期间均显著严重于根淹组。 根淹组在水淹初期叶片形态无明显变化，至水淹 30 d 才有少量叶片出现卷曲和萎蔫现象，水淹结束后仍有部分叶片保持完整、健康。 深淹组叶片在水淹 15 d 开始出现萎蔫、黄化现象，水淹 30 d 后受害程度加剧，至水淹结束叶片基本全部腐烂、脱落，说明深淹对桑苗造成的伤害比根淹更严重。 然而，在水淹 75 d 深淹组的桑苗顶端接近水面处有新芽萌发，可见桑苗对深淹胁迫亦有良好的适应能力。 此外，水淹结束后部分桑苗恢复生长状况良好，表明 2 年生饲料桑苗具有很强的水淹耐受性，可以作为三峡库区消落带植被恢复的备选树种。 张建军等(2012)研究发现，1 年生桑苗在经历 90 ～ 118 d 没顶淹没后仍能正常萌发，根系发达的多年生桑苗在水深 13.2 m、水淹214 d 后能存活并发芽展叶，该结果与本研究相似。而徐子棋等(2015)研究认为，1 年生饲料桑苗对根淹胁迫有很好的适应能力，但无法适应长期没顶淹没，该结果与本研究不同，其原因可能是试验选用桑苗的苗龄不同。 可见，桑苗的品种、年龄等因素亦影响其耐淹特性，因此，今后有必要开展不同品种、不同年龄桑苗在冬涨夏落型水淹胁迫生境下的耐淹特性和生理生态学机制的研究。
3. 2 水淹胁迫下桑苗叶片的酶活性变化
水淹胁迫造成的缺氧会阻碍植物细胞内电子链的正常传递过程，导致植物体内活性氧产生及清除的平衡遭到破坏，过氧化物和超阴负离子的大量积累是导致植物生长受害的重要原因( Zhang et al.，2007;蔡 金 峰 等， 2008; 李 彦 杰 等， 2014; 李 艳 等，2016)。 抗氧化酶能够降低植物在逆境条件下的受害程度、维持其生存和生长。 试验结果显示，根淹组和深淹组桑苗叶片抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均显著高于对照组，这表明桑苗通过提高叶片内抗氧化酶活性以适应水淹胁迫。 且随水淹深度的增加，3 种酶活性呈现出显著的增加趋势，这是因为水淹深度越深其对植物的生长和光合作用产生的危害越大。 这与水淹处理下双穗雀稗 CAT、SOD、POD 等酶活性都随着水淹深度的增加而增加(谭淑端等，2013)、在生长季水淹过程中， 中山杉叶片 SOD、CAT、POD 酶活性均随水淹深度的增加显著增加(张艳婷，2016)研究结果一致。 此外，2 年生饲料桑苗叶片 SOD 酶活性在水淹前期显著升高，在水淹 90d 又呈现下降的趋势，而 CAT 和 POD 酶活性在水淹90 d 显著升高，这表明在水淹前期，桑苗通过提高SOD 酶活性以降低超阴离子自由基的伤害，但随水淹时间的延长，高活性的 SOD 酶会导致植物体内H2O2 的大量积累，损坏植物细胞功能(朱翠英等，2015)，而过氧化物的清除需要依赖 CAT 和 POD 两种酶的共同作用(田小磊等，2005)。 叶片 3 种抗氧化酶的这种相互协调作用是桑苗耐水淹胁迫的一种响应机制。
无氧呼吸酶与植物的耐水淹性密切相关(张艳婷等，2016)。本试验结果显示，与对照组相比2年生饲料桑苗叶片中 PDC、ADH 和 LDH 酶活性在水淹胁迫下均显著升高，说明水淹胁迫形成的低氧环境使桑苗由有氧呼吸转化为无氧呼吸。在相同水淹时间下，深淹组无氧呼吸酶的活性显著高于根淹组，且随水淹时间的延长3种酶的活性也表现出了较为显著的增加趋势，在水淹 90 d 达到最大值,表明桑苗叶片无氧呼吸酶的活性与其受水淹胁迫的程度呈正比。这与不同水淹胁迫处理下中山杉叶片中的3种无氧呼吸酶活性均随水淹深度增加而显著增加(张艳婷等，2016)、水淹胁迫导致湿生蓝果木根尖形态组织 ADH 活性增加(Angelov et al.，1996)、大豆根系中 ADH 活性在水淹胁迫下增加( Komatsuet al.，2011)等结果基本一致。
4 结 论
不同深度处理下的桑苗在水淹胁迫下均出现了不同程度的落叶现象。 根淹组桑苗在水淹期间其叶片受害程度显著轻于深淹组，但深淹组桑苗在水淹75 d 后仍能萌发出新芽，且根淹组部分植株在水淹结束后恢复生长良好。 因此，2 年生饲料桑苗具有很强的耐水淹能力。
水淹胁迫会导致 2 年生饲料桑苗叶片的抗氧化酶和无氧呼吸酶活性显著升高。 无氧呼吸的酶活性随水淹时间和水淹深度的增加均呈现出了显著的增加趋势，其活性可反映桑苗受水淹胁迫的程度，而SOD 与 CAT、POD 三种抗氧化酶通过相互协调作用以降低水淹对桑苗造成的伤害。
本研究表明，2 年生饲料桑苗表现出良好的适应水淹胁迫的能力，可作为三峡库区消落带生态修复的备选耐淹树种。
