摘 要：【背景】16S rRNA 基因序列分析已广泛应用于细菌的分类鉴定，但是存在一定局限性，而使用看家基因作为分子标记在近缘种及亚种间的系统发育分析中具有其独特的优势。【目的】研究 16S rRNA、uvrC (核酸外切酶 ABC，C 亚基)和 murE (UDP-N-乙酰胞壁酰三肽合酶)基因序列对干酪乳杆菌的近缘种及亚种的区分能力。【方法】采用分离自传统发酵乳中的 6 株干酪乳杆菌为研究对象，选取 uvrC 和 murE 基因片段，通过 PCR 扩增、测序，结合已公布的干酪乳杆菌的近缘种或亚种的相应序列计算遗传距离、构建系统发育树，并与 16S rRNA 基因序列分析技术进行比较。【结果】研究发现 Lactobacillus casei 及相近种间的 uvrC、murE 和联合基因 (uvrC-murE)构建的系统发育树拓扑结构与 16S rRNA 基因结果基本一致，区别在于相似性的不同，其分别为79.00%−99.16%、89.08%−99.20%、76.56%−99.69%和99.58%−100%。基于16S rRNA 基因不能区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种，而看家基因 uvrC 和 murE 基因序列能够很好地区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种，并且将 uvrC 和 murE 基因串联使用后，试验菌株与参考菌株的分类关系更加清晰。【结论】联合基因(uvrC-murE)可作为 16S rRNA 基因的辅助工具用于干酪乳杆菌的近缘种及亚种的快速准确鉴定。
关键词：干酪乳杆菌，系统发育分析，16S rRNA 基因，uvrC，murE
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是革兰氏阳性、兼性厌氧的乳杆菌属中的一个种，对营养条件和发酵条件要求严格[1]。它通常存在于生乳或发酵乳制品、人和动物的肠道以及新鲜蔬菜或发酵蔬菜制品中[2]。干酪乳杆菌是一种具有调节肠道菌群平衡、促进人体消化吸收以及增强免疫等多种功能的益生菌[3-4]。本研究团队自主分离、筛选自内蒙古地区传统发酵酸马奶中的 Lactobacillus casei Zhang 是性能优异的益生菌[5]，它具有较强的耐人工胃液、胆盐消化、免疫调节、抗氧化等益生功效[6-9]。
长期以来，干酪乳杆菌及其近缘种的分类学地位一直存在争议。干酪乳杆菌菌群经历了从早期的 Lactobacillus casei subsp. casei、Lactobacillus casei subsp. alactosus、Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum 、 Lactobacillus casei subsp. tolerans 和 Lactobacillus casei subsp. rhamnosus，到 L. casei/paracasei、L. rhamnosus、L. zeae，直到现在 L. casei、L. paracasei、L. rhamnosus 的划分[10-14]。由此可以看出，干酪乳杆菌及其近缘物种间的亲缘关系错综复杂，种内分类学地位一直存在争议，基于传统的分类学方法只能勉强将其从种水平上区分开来，因此急需一种快速准确且分辨率较高的分类鉴定方法。随着分子生物学技术的迅速发展，产生了许多新的分类鉴定方法，如随机扩增 DNA 多态性[15]、种特异性 PCR[16]、核糖体分型[17]、转录间隔区序列分析[18]，但是以上方法在分类鉴定中存在一定的局限性。16S rRNA 基因序列的比较分析是细菌分类和鉴定的常用分子方法。但 Mori 等[19]研究发现干酪乳杆菌及其近缘种间的 16S rRNA 基因序列相似性超过 99%，因此使用该方法无法对干酪乳杆菌及其近缘种种内进行分类鉴定。刘光全等[20]尝试采用不同看家基因分析干酪乳杆菌群的系统进化关系，同时证明看家基因 pheS比 16S rRNA 基因具有更高的分辨率。这提示我们，看家基因能够区分鉴定干酪乳杆菌及其近缘种间的系统发育关系。
本研究分析了 12 株干酪乳杆菌的 16S rRNA、看家基因 uvrC (核酸外切酶 ABC，C 亚基)和 murE (UDP-N- 乙酰胞壁酰三肽合酶 ) 基因序列，与 GenBank 数据库中下载模式菌株的 16S rRNA、 uvrC 和 murE 以及 uvrC-murE 串联基因序列比对分析，对 12 株干酪乳杆菌的系统发育关系进行全面地阐述。本研究为我国优良益生菌株的筛选及快速鉴定奠定坚实的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株
研究所用 6 株干酪乳杆菌均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供，详细信息见表 1。Bao 等[2]运用 10 种看家基因(carB、 clpX 、 dnaA 、 groEL 、 murE 、 pyrG 、 pheS 、 recA、rpoC、uvrC)对 224 株干酪乳杆菌进行多位点序列分型研究(MLST)，本研究从中随机选取 6 株干酪乳杆菌(为了方便描述，下称已发表菌株)，共构建 12 株菌的菌株集，以验证本研究中分型方法的普适性。菌株的具体信息见表 2。另外，本研究还选取 5 株干酪乳杆菌及其近缘种的模式菌株作为参考菌株，具体信息见表 3。
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1.1.2 主要试剂和仪器
MRS 培养基，广东环凯有限公司;PCR 试剂，大连 TaKaRa 公司;Applied biosystems PCR 仪，伯乐公司;微量紫外分光光度计，NanoDrop 公司;全自动高压蒸汽灭菌器，Hirayama 公司;恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司;凝胶成像分析系统，UVP 公司;电热恒温培养箱，北京一恒科技有限公司;电子天平，上海精天电子仪器有限公司;高速冷冻离心机，Eppendorf 公司;电泳仪，北京六一生物科技有限公司。
1.1.3 试验所用引物
通过比较基因组学分析，选择 uvrC 和 murE 两个单拷贝且含有多变区的基因为目标序列。结合序列比对信息，采用 Primer 5.0 设计通用引物(表 4)，引物由上海美吉生物医药科技有限公司合成。
1.2 DNA 提取、PCR 扩增和测序
采 用 CTAB-液氮冻融法提取菌株基因组 DNA[21]。将提取的基因组 DNA 稀释至 100 ng/μL 左右作为PCR扩增模板。PCR反应体系(50 μL)：DNA 模板(100 ng/μL) 1 μL，10×Easy Taq buffer (Mg2+) 5 μL，High Pure dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，正、反向引物(10 mmol/L)各 1.5 μL，DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.5 μL，去离子水补充至 50 μL[22]。uvrC 基因的 PCR 反应条件：95 °C 5 min;95 °C 1 min，60 °C 45 s，72 °C 1 min，30 个循环;72 °C 10 min。murE 基因的 PCR 反应条件除了退火温度为 52 °C，其余反应条件均与 uvrC 基因一致。PCR 产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并将扩增成功的产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。
1.3 序列分析与系统发育树的构建
6 株试验菌株的 uvrC 和 murE 基因扩增产物经纯化、测序获得其相对应的核苷酸序列，上传至 NCBI，已获得登录号(表 1)。所有菌株的 16S rRNA基因序列均下载自GenBank数据库(序列登录号见表 1、表 2 和表 3)，6 株已发表菌株及 5 株参考菌株的 uvrC 和 murE 基因序列从 GenBank 数据库中下载(序列登录号见表 2、表 3)。采用 MEGA 6.0 软件进行 ClustalW 比对，运用邻接法 (Neighour-Joining，N-J)分别构建基于 16S rRNA、 uvrC 和 murE 基因序列以及 uvrC-murE 串联序列的系统发育树，数据自展重复抽样次数 1 000 次。
2 结果与分析
2.1 基于 16S rRNA 基因的系统发育分析
根据 12 株试验菌株和 5 株参考菌株的 16S rRNA 基因序列，采用 N-J 法构建系统发育树，计算其进化距离，结果如图 1 所示。结果显示， 17 株菌共划分为两大类(I、II)，I 类群分为 2 个亚群(A、B)。I 类群的 A 亚群中 12 株菌株与 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 、 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 聚为一类，它们两两之间的16S rRNA基因序列平均相似性均为 99.99%。其中，模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 和 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 以 100%的相似性聚为一类。 A 亚群菌株与 B 亚群中的菌株 L. casei DSM20011T 、L. zeae DSM20178T 两两之间的平均相似性为 99.70%。I 类群与 II 类群的平均差异性较小，仅为 0.46%。
刘光全等[20]研究发现干酪乳杆菌与其近缘种的一致性都在 99%以上，二者不能通过 16S rRNA 基因被有效区分开。本研究得到相同的结果， 16S rRNA 基因序列很难区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种，需要选用一种比 16S rRNA 基因分辨率高的方法对其进行分类鉴定。
2.2 基于 uvrC 基因部分序列的系统发育分析
基于 uvrC 基因部分序列构建的系统发育树中，12株试验菌株与5株参考菌株构建的系统发育树仍形成较为稳定的两个大类(I、II)，I 类群分成 3个亚群(A、B、C)，但相似性与16S rRNA基因不同。如图 2 所示，I 类群中 12 株菌株和 3 株参考菌株聚为一类。 A 亚群即菌株 IMAU10787 、 IMAU70074、IMAU10541、IMAU70046 与参考菌株 L. casei DSM20011T 为一个分支，菌株 IMAU80810、IMAU80732、IMAU80853 与参考菌株 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T聚为一小分支，菌株 IMAU10532 、 IMAU80452 、 IMAU10847、IMAU20578 和参考菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T聚为 C 类，它们基因序列两两之间的相似性大于 97.38%。IMAU80303 未与参考菌株划分为一类，它与模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 、 L. casei DSM20011T 、 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 的相似性分别为 98.46%、99.12%、 98.68%。A亚群与B亚群两两菌株之间的基因平均相似性为 81.63%，与 C 亚群之间基因平均相似性为 79.00%。Ⅱ类群中 L. rhamnosus DSM20021T和 L. zeae DSM20178T的基因差异性为 19.16%，比 16S rRNA 基因序列有更大的差异性。结果显示，相较于 16S rRNA 基因序列，uvrC 基因序列在干酪乳杆菌的近缘种及亚种的分类中有较高的分辨率。
2.3 基于 murE 基因部分序列的系统发育分析
基于 murE 基因部分序列构建的系统发育树如图 3 所示，12 株菌与 5 株参考菌构建的系统发育树仍形成较为稳定的两个大类(I、II)。I 类群中 12 株菌和 3 株参考菌聚为一类，I 类群又分为 3 个小的分支(A、B、C)。菌株 IMAU80303、IMAU10847 和参考菌株L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 聚为一小分支，菌株 IMAU10532、IMAU80853、 IMAU80452 、 IMAU80810 、 IMAU20578 、 IMAU80732 与参考菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 聚 为 B 类，菌株 IMAU10541 、 IMAU70046、IMAU10787、IMAU70074 与参考菌株 L. casei DSM20011T聚为另一分支。它们基因序列两两之间的相似性大于 98.81%。A 亚群与 B 亚群两两菌株之间的基因平均相似性为 92.47%，与 C 亚群之间基因平均相似性为 89.08%。模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 和 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T的平均差异达到 0.2%，比 16S rRNA 基因序列有更大的差异性。结果表明，murE基因区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种的分辨率高于 16S rRNA 基因，因此利用 murE 基因能很好地区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种。
