摘要：【背景】鄂尔多斯地区传统自然发酵苦菜风味和作用独特，但目前尚无关于发酵苦菜中乳酸菌种类及其生物学特性研究的报道。【目的】获得适用于工业化生产特性优良的乳酸菌。【方法】通过测定总酸度筛选高产酸菌株，并进行形态学鉴定、生理生化特性研究，以及16SrRNA基因片段分析。【结果】经鉴定5株高产酸的菌株均为植物乳杆菌，生长温度范围宽，并且具有耐酸、耐碱、耐盐、耐热的特性。【结论】试验菌株具有优良的生理特性和潜在的益生特性，可用于食品工业的生产。
关键词：发酵苦菜，乳酸菌，高产酸，鉴定，生理生化特性
苦菜是菊科苦荬菜属草本植物，在我国分布广泛，具有清热解毒、消炎抑菌、提高免疫力等食药用功效[1]。在内蒙古中西部及山西的许多地域，民间流传着食用苦菜的习俗，而且在鄂尔多斯地区农牧民在夏季将苦菜通过微生物作用酸渍保藏，可一直食用到冬季。这种发酵苦菜除了苦菜本身的作用，细菌的作用如何、细菌与苦菜的关系如何?在以苦菜为主料基质中的乳酸菌又有什么特殊性?这些问题一直备受研究者关注。但目前国内尚未有针对自然发酵苦菜中优势菌的分离及特性研究的报道。有研究报道自然酸渍蔬菜中的优势菌为乳酸菌，它具有抑制肠道病原菌、调节肠道菌群平衡等益生特性[2-3]。针对乳酸菌酸渍菜而言，乳酸菌的产酸量以及产酸条件直接影响酸渍产品的品质和生产，所以高产酸乳酸菌的筛选以及特性研究对乳酸菌在酸渍蔬菜中的应用有重要意义。鉴于此，本研究从鄂尔多斯市白泥井镇地区农户自然发酵腌制的苦菜汁中筛选出5株高产酸的乳酸菌，并对其进行了鉴定和生理特性的研究，这将为发酵蔬菜提供优良菌种资源，并且为发酵蔬菜的工业化生产提供试验数据，也为当地特色发酵食品有益作用的进一步研究提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
采集自内蒙古鄂尔多斯市达拉特旗白泥井镇地区5户农户家中的夏季腌制苦菜汤，共9个样品。
1.1.2标准菌株
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CICC6238，代号为ZB，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.3培养基、主要试剂及仪器
TPY、MRS、GYP培养基及产酸菌株筛选培养基等均按照参考文献[4-6]的方法配制。所用试剂均为分析纯，购于天津市风船化学试剂科技有限公司;生化特性鉴定及糖发酵试验所用试剂均购于广东环凯微生物科技有限公司和杭州滨和微生物试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购于北京天根生物科技有限公司;DNAmarkerDL2000、6×Loadingbuffer和2×EasyTaqSuperMix购于TaKaRa生物工程(大连)有限公司。
紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司;生化培养箱，上海恒科技有限公司;电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂;电泳仪，北京百晶生物技术有限公司;光学显微镜，Olympus公司;PCR仪，AppliedBiosystems公司。
1.2方法
1.2.1酸性样品乳酸菌的分离与纯化
将酸苦菜汤样品分别接种到TPY培养基中，37°C培养24h，将一代菌液接种到MRS液体培养基中，37°C培养24h，得到的第2代菌液继续接入MRS液体培养基，37°C培养24h得到活性较高的第3代菌液。将第3代菌液在产酸菌株筛选培养基上进行划线分离，在37°C、7%CO2浓度条件下厌氧培养24−48h，挑取有明显溶钙圈的菌落，然后在MRS平板上继续划线分离纯化，挑选革兰氏染色阳性、H2O2酶阴性、无芽孢符合乳酸菌特征的单菌落，并油镜镜检、保存，以备筛选、鉴定使用。
1.2.2供试菌液的制备
将保存的菌株活化3代，第3代菌液3000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌体加入等量的无菌生理盐水洗涤3次后，加入等量无菌生理盐水混匀，待用。
1.2.3高产酸菌株的筛选
将保存的菌株活化3代，按1.2.2所示的方法制备供试菌液并接种到100mL的MRS液体培养基中，37°C培养72h取发酵液lmL置于三角瓶中，用50mL蒸馏水稀释，滴加2滴0.1%酚酞为指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液滴定溶液至微红色，记录消耗的NaOH标准溶液体积，每个菌株平行测定3次，酸度以100mL发酵液中的产酸量计[7]。
1.2.4高产酸菌株的特性试验
(1)乳酸定性试验：对筛选出的高产酸菌株进行薄层层析实验，以2%的乳酸标准溶液作为对照。展开剂为水:苯甲醇:正丁醇=1:5:5(体积比)，并加入1%的甲酸。以0.04%的溴甲酚紫酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析板喷洒并计算Rf值[8]。
(2)形态特征观察：将筛选到的高产酸菌株接种到MRS固体培养基，37°C培养24h，观察菌落特征，挑取典型单菌落，涂片进行革兰氏染色，在油镜下观察菌体的形态。
(3)生化特性试验：按照参考文献[4-5,9]进行H2O2酶试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验、V-P试验、枸橼酸盐利用试验、糖发酵试验、运动性检查、葡萄糖产气试验。以上试验均使用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CICC6238作为对照。
(4)16SrRNA基因片段序列分析：将活化好的3代菌液，按试剂盒说明提取各试验菌株的全基因组DNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检验DNA纯度。PCR扩增的引物为27F(5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)ʹ和1495R(5ʹ-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)ʹ，扩增片段长约1500bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系(50μL)：模板DNA2μL，上、下游引物(10μmol/L)各2μL，2×EasyTaqSuperMix25μL，ddH2O补足至50μL。PCR反应条件：94°C3min;94°C30s，65°C30s，72°C1min，共35个循环;72°C5min。PCR扩增产物由1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。
1.2.5生理特性研究
(1)生长曲线的测定：将菌株按2%的接种量接种于MRS液体培养基中37°C培养，分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32、40、48、60、72h取样测定OD600值;在0、2、4、8、12、16、20、24、28、32、40、48、60、72h取样测定活菌数，绘制生长曲线。
(2)耐盐试验：将菌株分别接种于NaCl浓度为0、2%、6%、10%(质量体积比)的MRS液体培养基中，37°C培养24h，测定OD600值。
(3)pH试验：将菌株分别接种于pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、9.0的MRS液体培养基中，37°C培养24h，测定OD600值。
(4)温度试验：将菌株接种于MRS液体培养基中，分别在15、25、45°C培养24h，测定OD600值。
(5)耐热试验：将菌株接种于MRS液体培养基中，放置于60°C水浴锅加热处理30min，37°C培养24h，测定OD600值。以上试验均以不接菌的空白MRS培养基为对照。
2结果与分析
2.1酸性苦菜样中乳酸菌的分离
从9个发酵苦菜样品中分离得到了18株符合乳酸菌特性的菌，编号分别为1-1、1-2、2-11、2-17、3-1、3-2、3-3、5-3、5-4、6-5、6-6、7-1、7-4、7-5、7-9、9-3、9-5、9-8。
2.2高产酸菌株的筛选结果
测定18株菌的最终发酵酸度结果如图1所示，在相同培养条件下，各菌株最终发酵酸度不同，筛选出5-4、7-5、1-2、1-1、6-6这5株产酸量较高的菌，其中5-4的酸度为2.479×10−2mol，7-5的酸度为2.447×10−2mol，1-2的酸度为2.436×10−2mol，1-1的酸度为2.424×10−2mol，6-6的酸度为2.427×10−2mol，而空白培养基的酸度为0.530×10−2mol，5株菌均比空白培养基的酸度提高近5倍，将所有平行测定的数据进行显著性分析，差异性显著(P<0.05)。
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2.3高产酸菌株鉴定结果
2.3.1乳酸薄层层析定性结果
乳酸薄层层析定性实验结果为样品的斑点与乳酸标准品的斑点处于同一位置，测定乳酸标准溶液和筛选出的5株乳酸菌的Rf值并进行比较，结果见表1。Rf值为0.3−0.8，结果可信。
2.3.2形态特征鉴定结果
筛选的5株菌的菌落形态以及镜检结果如图2和表2所示，5株菌的菌落均为圆形，但其直径有较大差异，其中5-4的菌落为小菌落，1-2的菌落为大菌落，颜色均为乳白色，表面均光滑，边缘整齐，镜检结果均为革兰氏阳性，无芽孢的短杆菌，符合乳酸菌的特征。
2.3.3生化特性鉴定结果
由表3结果可以看出，筛选出的5株菌过氧化氢酶试验、V-P试验、尿素酶试验和枸橼酸盐利用试验均为阴性，无运动性，可以利用葡萄糖但不产气，因此可判定为同型发酵乳杆菌。
由表4糖发酵试验可见，筛选出的5株菌均可以利用D-核糖、阿拉伯糖、半乳糖、纤维二糖、果糖、水杨苷、蜜二糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖，均不能利用棉籽糖和木糖，对山梨醇、甘露醇和鼠李糖的发酵特性各不相同，其中菌株5-4可以利用山梨醇和鼠李糖，菌株1-1和7-5可以利用甘露醇。
分析上述试验结果，根据《伯杰细菌鉴定手册》[10]和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[11]对菌株进行种内鉴定，菌株5-4与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)特性相似，但是不利用甘露醇，菌株7-5和1-1与小鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)特性相似，但不利用棉籽糖，菌株6-6和1-2的特性与米酒乳杆菌(Lactobacillussake)特性相似，但不利用山梨醇。由于传统的发酵特性不稳定因素较多，部分菌株亲缘关系较近造成结果不容易区分[12]，所以需要进一步通过16SrRNA基因片段序列分析来鉴定。
2.3.416SrRNA基因片段序列分析结果
用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析16SrRNA基因的PCR产物，如图3所示，试验菌株和标准菌株均在1500bp处出现特异性目的条带，与预期大小符合，而且产物条带单一，满足测序要求。
利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)将5株菌的16SrRNA基因片段序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知序列进行比对，5株菌均与植物乳杆菌(L.plantarum)的相似度最高，可达99%。利用MEGA5.0绘制系统发育树进行同源性分析，结果如图4所示，5株试验菌株和标准菌株ZB均与植物乳杆菌(L.plantarum)的相似性最高，在系统发育树上处于同一分支，与BLAST的分析结果相一致。可以判定5株菌均为植物乳杆菌(L.plantarum)。
2.4高产酸菌株的生理特性
2.4.1生长曲线
由菌株的生长曲线(图5、6)和pH变化曲线(图7)可以看出，菌株5-4和7-5的生长情况基本相似，延滞期较短，约2h开始进入对数期，8h进入稳定期，32h进入衰亡期，pH最低分别降至3.78和3.79。菌株1-1、1-2和6-6的生长情况相近，4h开始进入对数期，8h进入稳定期，对数期持续时间较短，但菌株生长较快，1-1和1-2在28h进入衰亡期，而菌株6-6在40h进入衰亡期，而且活菌数降低较为缓慢。3株菌的pH变化曲线较为平缓，最低pH分别为3.01、3.00和2.98，产酸能力较强。
2.4.2耐盐试验结果
由图8可以得出，当培养基的NaCl浓度为2%时，所有试验菌株的生长基本不受影响;当培养基的NaCl浓度为6%时，各菌株均受到轻微的抑制，而且受影响的程度相近;当培养基的NaCl浓度为10%时，5株菌的生长均受到明显的抑制，受影响的程度同样接近。
2.4.3pH试验结果
由图9可见，培养基的初始pH值对菌株生长有较大的影响，试验的5株菌受初始pH的影响接近，在培养基pH<3.5时，所有试验菌株的生长开始受到明显的影响;其中菌株6-6在pH4.5时的OD600值显著高于在其他pH，同样也显著高于其他试验菌株在pH4.5时的OD600值。
2.4.4温度和耐热试验结果
由图10可以看出，试验菌株在25°C正常生长，与标准37°C培养环境下的生长情况相比无明显差异;所有试验菌株在15°C生长良好，受低温影响不明显，其中菌株1-1和1-2在15°C时的OD600值略高于其余3株试验菌株，45°C的高温明显影响菌株1-1和1-2生长，说明菌株1-1和1-2在低温下生长良好，而试验菌株5-4、6-6和7-5受高温影响不明显，在45°C下的OD600值略低于37°C条件下的OD600值，它们适于较高温度环境中生长。
