[摘要]目的运用转录组测序技术研究内蒙古地区特禀体质与平和体质人群差异基因的表达，以期从分子水平探讨中医特禀体质的成因、特征及相关过敏性疾病的发生机制。方法对2015年9月～2016年9月内蒙古医科大学第一附属医院、通辽市医院以及巴彦淖尔市医院体检中心的受检者进行流行病学调查，筛选祖辈三代均生活在内蒙古地区的特禀体质和平和体质人群为研究对象，各取10例受试者外周血进行转录组测序，对所得高表达基因进行qPCR验证来反映部分差异表达基因及其相关通路与特禀体质的相关性。结果与平和体质比较，特禀体质的所有下调基因中，HLA-DRB1、HLA-DRB5和HLA-DQA2均富集在哮喘通路上;Toll样受体2(TLR2)差异表达基因富集在与特禀体质关系密切的TLR信号通路上。qPCR验证发现特禀体质CPNE3基因相对表达量明显高于平和体质，差异有统计学意义(P<0.05)。结论HLAⅡ类基因与特禀体质密切相关且在特禀体质中差异表达;基因TLR2参与的TLR信号通路体现了过敏性疾病的信号传导机制可能与特禀体质密切相关;CPNE3基因表达在特禀体质和平和体质中存在差异，提示两种体质间基因表达可能存在一定差异，但仍需进一步研究。
[关键词]转录组测序技术;特禀体质;表达基因
转录组测序技术，是指建立在新一代高通量测序平台基础上的cDNA测序技术，能够在单核苷酸水平对特定基因组的整体转录活动进行检测[1]。与基因芯片杂交技术相比，转录组测序无需预先设计探针或了解物种的基因组信息，即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测，全面快速地获得该基因组在某种状态下几乎所有的转录本信息[2]，具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。王济等[3]从中医角度构建了特禀体质的相关理论，但目前关于特禀体质分子机制的研究尚不够充分，且以转录组测序为依托的转录组学研究相对较少。与许多中医理论的现代研究相类似，要想深入研究特禀体质形成的微观机制，需要找到一个正确的切入点。因此，以转录组测序技术为研究切入点，既可研究已知基因，亦能发掘未知基因，不仅能从微观世界探求中医特禀体质的成因和特征，而且在预防过敏性疾病的发生及缓解其临床症状方面均起到重要的作用。因此本文将通过运用此技术对内蒙古地区特禀体质基因表达差异进行研究，报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
以2015年9月～2016年9月内蒙古医科大学第一附属医院、通辽市医院以及巴彦淖尔市医院体检中心的2400份临床流行病学调查体质量表(参照2009年由中华中医药学会颁布的《中医体质分类与判定》标准)为基础，共筛选出20例研究对象，其中平和体质10例，特禀体质10例。本研究已通过内蒙古医科大学医学伦理委员会审查。
1.2纳入与排除标准
纳入标准：符合特禀体质、平和体质判定标准者;祖辈三代均生活在内蒙古自治区境内;年龄>15~<80周;愿意接受临床试验并签署知情同意书者。排除标准：符合特禀体质判定标准，但兼夹其他体质类型者;合并器质性病变者;合并病毒或细菌感染以及传染性疾病者;合并精神疾患者;合并其他严重疾病者。
1.3仪器与试剂
1.3.1仪器NanoDrop2000c微量紫外可见分光光度计(美国ThermoScientific公司);小型水平电泳槽MiniSubCellGtCell(美国Bio-Rad公司);TBS380(美国Invitrogen公司);AgilentTechnologies2100Bioanalyzer[美国安捷伦(Agilent)科技公司];Bio-Rad凝胶成像仪GelDocXP(美国Bio-Rad公司);HiSeq4000(美国Illumina公司);LEGENDMICRO21R台式高速冷冻离心机(美国ThermoFisher公司);Nanodroplittle核酸浓度测定仪(美国ThermoFisher公司);7900FastAppliedbiosystemsqPCR仪(美国ThermoFisher公司)。
1.3.2试剂人外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：RT122-01);TRIzol誖Reagent(美国Invitrogen公司，货号：DP405-02);CertifiedLow-RangeUltraAgarose(美国Bio-Rad公司);TruSeqTMRNASamplePrepKit、TruSeqPEClusterKitv3-cBot-HS、TruSeqSBSKit(300cycles)、Picogreen(美国Illumina公司);UltraPureAgarose(美国ABI-invitrogen公司，批号：16500100);SuperScriptⅢRT反转录kit(美国ABI-invitrogen公司，批号：11752050);SybrqPCRmix(美国ABI-invitrogen公司，批号：4472920)。
1.4样本采集
采血前嘱受试者采血前1d禁酒和劳累，女性避开月经期，在空腹12h后于清晨使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集肘静脉血8mL，并充分颠倒使EDTA和血液混合，以防出现局部凝血的问题，保证在8h内成功分离单个核细胞。
1.5转录组测序
通过TRIzol法提取TotalRNA，通过RNA琼脂糖凝胶电泳，对总RNA样品质量进行检测。TotalRNA通过文库构建而后在IlluminaHiSeq4000测序平台进行测序分析。
1.6qPCR验证
利用qPCR定量试剂盒进行PCR扩增，每个样本分别用待检测基因和内参基因引物扩增，每个反应做3个重复，按照dNTP(10μmol/L)、0.1μmol/LDTT、5×Buffer、RT酶体系建立扩增体系，于ABI7900qPCR仪上，按照95℃/2min、94℃/20s、60℃/20s、72℃/30s40循环的条件进行反应，引物序列见表1。
1.7统计学方法
用SPSS21.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，若符合正态分布，则采用独立样本t检验，若不符合正态分布，则采用非参数检验。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1表达差异分析
与平和体质比较，特禀体质差异表达转录本中共计2011个基因，其中下调基因有1248个，上调基因有763个。见图1(封三)。
2.2差异基因注释
2.2.1差异基因GO注释与平和体质比较，特禀体质差异基因在生物学过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)三大类中分别包含了21、20和15个功能小类。在BP这一类中，差异表达基因在生物调节、细胞过程、代谢过程、单一生物过程等10个小类中所占比例均较高。在CC这一类中，细胞、细胞部分和细胞器3个功能小类所占比例相对较高。在MF这一类中，结合和催化活性这2个小类所占比例相对较高。见图2(封三)。
2.2.2差异基因KEGG注释在2个KEGG代谢通路图中，基因TLR2、PI3k、TBK1、NF-κB、IL-1β在Toll样受体信号通路途径明显上调，基因MHCⅡ在哮喘信号通路途径明显下调。见图3。
2.3差异基因富集分析
对特禀体质与平和体质标本的差异基因进行GO富集分析，其数量为2604，其中BP为2038，CC为227，MF为339，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见图4(封三)。
2.4表达模式聚类
对特禀体质与平和体质进行表达模式聚类分析，发现特禀体质与平和体质的基因表达有明显差异。见图5(封四)。
2.5qPCR结果
特禀体质CPN3基因相对表达量明显高于平和体质[(7.92±4.80)vs.1]，差异有统计学意义(P<0.05);特禀体质LAMTOR3、CXCR2基因相对表达水平与平和体质比较[(7.68±6.72)vs.1，(5.41±3.62)vs.1]，差异无统计学意义(P>0.05)。
3讨论
本研究发现HLA-DRB1、HLA-DRB5和HLA-DQA2三个基因呈现差异性表达，其属于位于HLAⅡ类基因区中经典基因HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ上的功能基因。本研究中3个差异表达的基因均富集在哮喘通路上，以往也有研究证实哮喘的某些特异性抗原呈递需要特异性HLA-DR基因产物，HLA-DR基因及其表达水平与IgE的密切关系可能是哮喘发病及其预后判断的特异性指标[4-7]。而本研究通过对特禀体质与平和体质进行比较，发现HLAⅡ类基因的差异表达与上述研究结果一致，提示HLAⅡ类基因可能是特禀体质的特异表达基因。先天因素和后天环境交互作用是形成特禀体质的关键，因此，内蒙古地区特禀体质人群可能存在特殊的差异表达基因，这为寻求针对本地过敏性疾病更为合理有效的预防和治疗提供研究方向。
本研究同时发现了特禀体质差异表达的TLR2基因及其参与的Toll样受体信号通路发生过敏性疾病的信号转导机制，表明该通路与特禀体质密切相关。以往研究发现当TLRs信号传导途径异常活化时，可干扰机体自身免疫耐受机制，导致免疫功能紊乱[8-9]。其分泌的细胞因子能够介导炎性反应，且可促使T淋巴细胞分化及成熟[10-11]，TLR的不同表型和配体以及树突细胞(DC)表面共刺激分子的差异，均可使T辅助细胞(Th)向不同的方向分化，因而在过敏性疾病中发挥着双刃剑的作用[12]。Saluja等[13]研究发现肥大细胞上TLRs的表达与哮喘的发生发展关系密切;杨玲等[14]通过实验证实TLR2是具有特异性的活性受体。大量研究证实调节性T细胞能够抑制Th2细胞的增殖分化以及细胞因子的产生，TLR2活化可能通过减弱调节性T细胞的抑制作用进而诱发Th2型过敏性炎症的发生[12]。以上研究表明特禀体质差异表达的TLR2基因及其参与的Toll样受体信号通路与过敏性疾病密切相关，当机体受到各种病原相关分子模式(PAMP)刺激时，通过启动Toll样受体信号通路进行信号转导，进而引发机体产生过敏反应，因而TLRs及其信号通路在特禀体质的形成中发挥着重要的作用，这为今后从该信号途径入手探索新的调体方案提供了强有力的科学依据。
同时，本研究在转录组测序中发现的2000多个基因中筛选出了表达相对较高的CPNE3、LAMTOR3、CXCR2三个基因进行了qPCR验证，其中CPNE3基因在平和体质与特禀体质中的表达存在差异，且差异有统计学意义。以往研究发现CPNE3基因的表达可以作为急性心肌梗死和稳定性冠状动脉疾病的潜在预测标志[15]，是促进稳定性冠心病患者发生急性心肌梗死的重要遗传因素之一[16]。但其并不仅仅表现在心血管疾病中，在肺腺癌组织中的表达也明显增高[17]。在以往对CPNE3基因的研究中发现其在特禀体质中的表达研究相对较少，本研究发现其表达在特禀体质与平和体质中确实存在一定的表达差异，提示CPNE3基因可能与特禀体质存在一定的相关性，不过仍需进一步的研究才能证实，因此可以为今后的研究提供参考方向。
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综上所述，特禀体质与平和体质在HLA-DRB1、HLA-DRB5和HLA-DQA23个基因呈现差异性表达;特禀体质差异表达的TLR2基因及其参与的Toll样受体信号通路被发现发生过敏性疾病的信号转导机制，提示此通路与特禀体质密切相关;CPNE3基因在平和体质与特禀体质中的表达存在差异，提示在内蒙古地区平和体质与特禀体质间基因的差异表达可能在这方面表现较为明显。
