摘要
背景：在关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养环境中，软骨细胞功能活跃，增殖速度加快，骨髓间充质干细胞促进了软骨细胞的表型维持，而且少量软骨细胞提供的微环境能够诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化，降低了软骨分化过程中出现的肥大表型和软骨内骨化，但是影响共培养系统中细胞增殖分化的因素和细胞间相互作用的机制尚不明确。目的：观察软骨细胞和骨髓间充质干细胞接触共培养对细胞增殖分化的影响，进一步优化共培养方式，为探讨共培养系统中二者的相互作用机制提供依据。方法：分离和培养新西兰兔(南京医科大学实验动物中心提供)软骨细胞和骨髓间充质干细胞，取第 2 代软骨细胞和骨髓间充质干细胞，以 1∶3 的比例直接混合在 24 孔板进行接触共培养为接触共培养组，以 1∶3 比例分别在 Transwell 的上室和下室进行非接触共培养为非接触共培养组，共培养 21 d。细胞爬片进行甲苯胺蓝染色、COL2a1 及 Cx43 细胞免疫化学染色。应用 CCK8 检测共培养系统中细胞的增殖情况，ELISA 检测共培养细胞上清液中糖胺聚糖和转化生长因子 β3 水平，Western blot 检测共培养细胞 COL2a1 和 Cx43 的表达。然后添加转化生长因子 β3 进行软骨细胞和骨髓间充质干细胞接触共培养和非接触共培养，比较细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 蛋白表达的变化。结果与结论：①随着共培养时间的延长，细胞增殖能力逐渐增高，接触共培养组细胞吸光度值明显高于非接触共培养组(P < 0.05)，糖胺聚糖和转化生长因子 β3 水平以及 COL2a1 和 Cx43 的蛋白表达明显高于非接触共培养组;②添加 10 µg/L 转化生长因子 β3 共培养 21 d，接触共培养组细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 的表达与未添加转化生长因子 β3 比较无明显变化(P > 0.05)，而非接触共培养组的细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 蛋白表达明显提高(P < 0.05)，但仍明显低于未添加转化生长因子 β3 的接触共培养组(P < 0.05);③结果表明，接触共培养比非接触共培养明显促进细胞的增殖和分化，Cx43 在其中起重要作用。
关键词：关节软骨细胞;骨髓间充质干细胞;共培养;增殖;分化;糖胺聚糖;Ⅱ型胶原;转化生长因子 β3;缝隙连接;连接蛋白;干细胞
0 引言 Introduction
由于关节软骨无血管、神经组织，其自身缺乏有效的修复能力，组织工程技术为解决这一难题提供了新思路，安全可靠的种子细胞源是构建组织工程化软骨的前提。自体关节软骨细胞(articular chondrocytes，ACs)作为种子细胞，其在体外培养增殖能力低，连续传代后发生去分化丧失表达Ⅱ型胶原的能力，从而失去原有的表型，并且获取软骨细胞的来源受限，存在供区并发症;而骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为种子细胞则需要多种生长因子的诱导，分化过程中产生典型的肥大表型和骨化标志碱性磷酸酶及Ⅹ型胶原而发生软骨内骨化[1-3]。因此，ACs和BMSCs均不能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求，而将两种细胞进行共培养就成为可供选择的方式[1-6]。大量的研究和作者前期实验发现 ACs和BMSCs接触共培养能够促进ACs的增殖和表型维持，而且少量ACs为BMSCs提供了软骨分化的微环境，因此，ACs和BMSCs共培养为解决ACs来源不足提供了切实可行的途径[3-6]，但是影响共培养系统中细胞增殖和分化的因素及调节细胞之间作用的机制尚不明确，为此，该研究观察ACs和BMSCs接触共培养对细胞增殖和分化的影响，进一步优化共培养方式，为构建工程化软骨提供新的策略。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学及分子生物学随机对比实验。
1.2 时间及地点 于2017年1至12月在徐州医科大学附属连云港市东方医院临床研究中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 健康2月龄新西兰兔12只，雌雄不限，体质量0.8-1.2 kg，由南京医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：201500099。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
1.3.2 实验试剂与仪器 DMEM培养基(Gibco公司，美国);青/链霉素(碧云天生物技术研究所，上海);胎牛血清 (Hyclone公司，美国);转化生长因子β3(Peprotech公司，美国);甲苯胺蓝染液(Sigma公司，美国);Transwell培养系统(Corning公司，美国);CCK8试剂盒(碧云天生物技术研究所，上海);Ⅱ型胶原酶(Gibco公司，美国);GAG定量分析酶联吸附分析试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司 USCN，武汉);转化生长因子β3免疫试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司USCN，武汉);Ⅱ型胶原(type II collagen， COL2)单克隆抗体(Novus，美国);连接蛋白43(connexin 43，Cx43)单克隆抗体(Abcam公司，美国);GAPDH单克隆抗体(Abcam公司，美国);HRP标记的山羊抗兔二抗(中杉金桥，北京);DAB显色剂(碧云天生物技术研究所，上海);相差显微镜(Olympus显微镜，日本);CO2恒温孵育箱 (Thermo公司，美国);酶标仪(Molecular Devices公司，美国);Tanon-5200化学发光仪(天能公司，上海)。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs和ACs的分离培养和共培养 应用作者所在实验室提供的方法进行BMSCs和ACs分离培养[3，6]。
在局麻下用骨穿针于新西兰兔胫骨和股骨骨髓腔抽取骨髓并且肝素化，应用密度梯度离心和贴壁培养法分离出 BMSCs，在体积分数5%CO2孵育箱中37 ℃饱和湿度条件下用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。
无菌条件下切取新西兰兔膝关节软骨，PBS漂洗后用眼科剪刀剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，应用0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶进行消化，200目滤网过滤后离心，用PBS漂洗再次离心后在同一条件下进行ACs培养。
实验取第2代ACs和第2代BMSCs以1∶3的比例进行接触共培养和非接触共培养，细胞总数为4×104 。
1.4.2 ACs和BMSCs接触共培养和非接触共培养 取第2 代ACs和第2代BMSCs，按1∶3的比例在上述同一条件下直接混合进行接触共培养为接触共培养组，按1﹕3的比例在Transwell的上室和下室进行非接触共培养为非接触共培养组。孔板底部和Transwell的下室均放置盖玻片进行细胞爬片。每3 d更换1次培养基，共培养21 d。
1.4.3 添加转化生长因子β3进行BMSCs和ACs接触共培养和非接触共培养 向接触共培养组和非接触共培养组分别加入10 µg/L的转化生长因子β3进行共培养21 d。
1.5 主要观察指标
1.5.1 共培养后细胞形态学变化以及免疫化学染色检测共培养细胞COL2a1和Cx43的表达 共培养21 d，取出细胞爬片，PBS冲洗后应用预冷的40 g/L多聚甲醛固定 10 min，加入甲苯胺蓝进行细胞染色，相差显微镜下观察细胞形态和蛋白多糖的合成。分别应用COL2a1和Cx43的鼠抗兔单克隆抗体进行细胞免疫化学染色评价共培养细胞 COL2a1和Cx43的表达。
1.5.2 CCK8试剂盒检测共培养细胞的增殖情况 取共培养细胞悬液100 μL接种至96孔板，每孔加入10 μL的CCK8 (n=6)，在培养箱中共孵育2 h，根据操作说明，应用酶标仪测定波长为450 nm处的吸光度值，根据吸光度值绘制共培养细胞的生长曲线。
1.5.3 ELISA法测定共培养系统中糖胺多糖和转化生长因子β3水平 收集共培养细胞的上清液，按照酶联免疫试剂盒操作说明检测共培养细胞上清液中糖胺多糖和转化生长因子β3水平。
1.5.4 Western blot检测共培养细胞COL2a1和Cx43的表达 共培养21 d，加入预冷的RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃ 下12 000 r/min离心10 min，收集细胞上清液。应用BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，加入5×RSB，煮沸5 min， -20 ℃保存。每个泳道加20-40 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，分别与COL2a1和 Cx43的单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗结合，检测上述蛋白的表达水平。应用Image J图像分析系统，根据蛋白条带灰度分析共培养细胞COL2a1和Cx43表达的差异。
1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计量资料用x _ ±s表示，符合正态分布的两组均数比较采用独立样本t 检验;多组比较采用单因素方差分析，各组之间两两比较采用q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 共培养细胞的形态变化 分离培养的第2代BMSCs 呈纺锤形或长梭形，细胞折光性强，与成纤维细胞形态相似，排列具有方向性，呈漩涡样或辐射状，见图1A。第2 代ACs呈多角形、三角形或不规则的卵圆形，核为圆形或椭圆形，可见成簇生长现象，细胞核居细胞中心，胞浆丰富，细胞增殖融合为单层，呈多边形或星形，排列紧密为 “铺路石”样，见图1B。
接触共培养组共培养4 h细胞开始贴壁，随着ACs和 BMSCs共培养时间的延长，长梭形细胞逐渐变为多角形、类圆形，呈聚集生长，形态接近软骨细胞。接触共培养21 d，甲苯胺蓝染色显示共培养细胞及其周围基质浓染，细胞核质分界清晰，细胞核被染成深蓝色，胞质染成蓝紫色，见图2A。细胞免疫化学COL2a1染色后胞浆染成棕黄色，胞核不着色，为强阳性，见图2B。
非接触共培养组共培养21 d，观察Transwell下室的 BMSCs，发现仅有部分细胞变为多角形或类圆形，大部分细胞仍呈长梭形或短梭形，甲苯胺蓝染色显示共培养细胞及其周围基质染色较浅，COL2a1染色为弱阳性，而ACs 体积和核浆比例变化不大，见图3。 2.2 ACs和BMSCs接触共培养对细胞增殖分化的影响随着ACs和BMSCs共培养时间的延长，共培养细胞平均吸光度值逐渐增高，共培养21 d接触共培养组细胞吸光度值明显高于非接触共培养组(P < 0.05)，见图4。培养上清液中糖胺多糖和转化生长因子β3水平，见表1。共培养细胞COL2a1和Cx43的表达明显高于非接触共培养组(P < 0.05)，见图5。
2.3 外源性转化生长因子β3对共培养细胞增殖分化的影响 接触共培养组和非接触共培养组添加10 µg/L转化生长因子β3进行共培养21 d，接触共培养组添加转化生长因子β3前后细胞增殖无明显变化(P > 0.05)，见图4，培养上清液中糖胺多糖水平和共培养细胞COL2a1及Cx43的表达增高也无显著性意义(P > 0.05);而非接触共培养组添加转化生长因子β3后细胞的增殖、培养上清液糖胺多糖水平和共培养细胞COL2a1及Cx43的表达则明显提高(P < 0.05)，但仍明显低于接触共培养组(P < 0.05)，见表1，图5和图6。
3 讨论 Discussion
关节软骨主要由透明软骨细胞和细胞外基质(以Ⅱ型胶原和多聚蛋白多糖为主)构成，无血管和神经支配，损伤缺损后难以自我修复[1-6]。组织工程学技术为解决这一难题提供了新方法，安全可靠的种子细胞源是构建组织工程化软骨的前提。ACs和BMSCs都可能用于构建组织工程化软骨，但是软骨细胞获取受限，并且体外培养增殖能力低，在连续传代后发生去分化丧失表达Ⅱ型胶原的能力，其表型难于维持，产生的细胞外基质以Ⅰ型胶原为主，其机械强度、弹性模量等力学性能较Ⅱ型胶原明显降低;而 BMSCs作为种子细胞则需要多种生长因子的诱导，分化过程中产生典型的肥大表型和骨化标志Ⅹ型胶原及碱性磷酸酶而发生软骨内骨化。因此，ACs和BMSCs均不能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求[1-6]。大量研究表明 BMSCs和ACs共培养能够促进ACs的增殖和表型维持，而且少量ACs为BMSCs的软骨分化提供了微环境，减少了 ACs的需要量，并且共培养可降低分化过程中出现的钙化和肥大表型[3-6]，但是影响共培养系统中细胞增殖分化的因素和调节机制尚不明确，因此研究ACs和BMSCs接触共培养方式对细胞增殖和分化的影响，可以优化共培养方式，对进一步探讨共培养系统中BMSCs和ACs相互作用机制奠定基础，为临床应用组织工程学技术修复关节软骨缺损提供理论支撑。
共培养系统中最佳的细胞比例是构建高质量组织工程化软骨的关键因素。不同共培养条件下两种细胞的最佳共培养比例尚未确定[7]。Kang等[8]研究表明ACs和BMSCs共培养中ACs的比例达到20%以上时，与同等数量单纯ACs 构建的软骨较为接近，当ACs达到一定数量时，增加ACs 的比例，BMSCs的诱导结果不发生改变，提示ACs对 BMSCs的诱导作用存在饱和现象，并且降低BMSCs在共培养系统中的比例，也会减少BMSCs对ACs的营养支持作用[9-10]。Meretoja等[11]研究表明1∶3的细胞比例既能维持 ACs的表型以及为BMSCs软骨分化提供微环境，又能明显减少ACs的用量，与Yao等[12]的研究结果一致。因此，该实验以1∶3比例的ACs和BMSCs进行共培养实验。
细胞接触共培养和经Transwell非接触共培养是不同的两种共培养方式，Transwell培养瓶的隔离膜孔径0.4 µm，仅能允许可溶性分子通过，而BMSCs和ACs不能自由通过，这就消除了细胞之间相互接触的影响。实验应用接触和非接触两种共培养方式对BMSCs与ACs增殖、分化的影响进行了比较研究，结果表明：接触共培养系统中糖胺多糖和转化生长因子β3水平及COL2a1的表达均高于非接触共培养，并且接触共培养系统中ACs体积增大，核浆比例提高，提示ACs功能活跃，增殖速度快，甲苯胺蓝染色及细胞免疫染色显示有大量的软骨陷窝形成和COL2a1的合成，说明接触共培养明显促进ACs的增殖和表型的维持， ACs的微环境诱导了BMSCs的软骨分化。Cx43存在于多种类型的细胞中，正常软骨组织和BMSCs均表达Cx43[13-15]， De Windt等[16]应用BMSCs和ACs进行共培养研究，结果表明BMSCs和ACs之间通过Cx43使两种细胞建立了缝隙连接通道。此次研究检测了共培养细胞的Cx43表达，结果表明接触共培养细胞Cx43及COL2a1的表达明显高于非接触共培养细胞，说明Cx43参与了共培养细胞增殖和分化的调节[16]。
ACs和BMSCs共培养促进细胞增殖和分化的机制是活性因子的营养作用还是直接接触的作用还存在争议[10，16-17]。为消除两种共培养系统中内生性转化生长因子对细胞增殖和分化的影响，该实验向ACs和BMSCs共培养系统中添加转化生长因子β3进行比较研究，结果表明：接触共培养细胞的增殖、糖胺多糖水平、COL2a1及Cx43的表达无明显变化，说明接触共培养细胞具有明显的成软骨活性和增殖能力，也侧面证实了ACs和BMSCs接触共培养不需要诱导因子的刺激。Dahlin等[18]在ACs和BMSCs共培养系统中应用不同质量浓度的转化生长因子β3进行诱导共培养，结果表明应用1 μg/L或10 μg/L转化生长因子β3共培养，共培养细胞产生同样的糖胺多糖，与ACs或BMSCs单层培养比较，共培养有效降低了转化生长因子β3的用量和时间，达到了同样的软骨分化水平;去除转化生长因子β3 刺激后，共培养细胞的软骨分化表型更稳定。因此，共培养系统的微环境提高了共培养细胞对生长因子反应的敏感性[19-20]。该研究添加转化生长因子β3进行非接触共培养，共培养细胞的增殖、糖胺多糖水平、COL2a1及Cx43的表达增强，但仍明显低于未添加转化生长因子β3的接触共培养，说明细胞间直接接触比转化生长因子促进共培养细胞增殖和分化的作用更为重要，Cx43的表达水平影响了细胞的增殖和分化，与Zuo等[7]和De Windt等[16]的研究结果类似。Schrobback等[21]在人BMSCs和ACs共培养系统中添加 Cx43阻断剂甘草次酸进行共培养，分析共培养细胞的软骨分化潜能，结果表明BMSCs和ACs共培养期间经甘草次酸阻断后，COL2和细胞外ATP减少及软骨分化潜能下降，进一步证实了Cx43的表达水平决定了共培养细胞的增殖和分化。因此，应用外源性Cx43或其类似物可能为构建工程化软骨提供新的策略[22-23]，但是具体的机制和详细的信号传导通路尚不清楚，需要进一步研究。
综上所述，ACs和BMSCs接触共培养能够明显促进细胞的增殖和分化，细胞间缝隙连接参与了共培养细胞增殖分化的调节，Cx43起到了重要作用。
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