[摘要] 目的：构建表达萤光素酶报告基因的重组人 7型腺病毒(HAdV7)Ad7-dE1-dE3-Luc(Ad7-Luc)病毒，用于检测人群中HAdV7的中和抗体水平。方法：利用同源重组方法构建E1区和E3区部分缺失，并在E1区嵌入萤光素酶基因表达框的pAd7-Luc重组质粒，转染HEK-293细胞，包装出能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7载体重组病毒(Ad7- Luc);选取HAdV7阳性血清样本对新建立的报告基因检测方法的准确性和稳定性进行验证;最后，利用该方法对北京地区60份血清样本进行HAdV7中和抗体检测。结果：获得能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7-Luc重组病毒，病毒滴度可达 4.85×108 IFU/mL，Ad7-Luc 检测法与传统细胞病变效应(CPE)法具有很好的一致性(R2 =0.8612，P<0.0001), 批内和批间差异分别在 10%和 20%以内。北京地区 60 例血清样本的检测结果显示，HAdV7 血清阳性率约为 60% (36/60)，明显低于 HAdV5 血清阳性率 75%(45/60)，75%的 HAdV7 阳性血清中和抗体滴度集中于低滴度水平(12~ 200)。结论：与传统的细胞病变方法相比，HAdV7 中和抗体报告基因检测方法更快速、灵敏、准确，适用于人群中 HAdV7血清流行病学调查及其疫苗的中和抗体研究。
[关键词] 人7型腺病毒;萤光素酶报告基因;中和抗体;血清流行病学调查
人腺病毒(human adenovirus，HAdV)属于腺病毒属，是一种无包膜的双链 DNA 病毒。已报道的 HAdV 有 90 种，根据血清学及分子学特性，分为 A~G 共 7 个亚群[1-2] 。腺病毒感染可引起多种临床综合征，包括呼吸道疾病、结膜炎、膀胱炎、肠胃炎、神经系统疾病等，某些情况下甚至能够导致死亡[3] 。据报道，HAdV 是世界范围内急性呼吸道疾病的主要原因之一，5%~10%的儿童下呼吸道感染是由其导致的[4] 。B 亚群的 3、7、14、21、55 型和 C 亚群的 1、2、5、6 型 HAdV 是全球范围内引起急性呼吸系统疾病的主要病原体[5] 。据世界卫生组织报告，7 型 HAdV(HAdV7)占所有 HAdV 感染的近 20%，并且引起的疾病也最为严重，特别是对于小于 7 岁的儿童和免疫缺陷人群[4,6-7] 。
HAdV7 也是造成我国腺病毒感染的主要血清型，近年来在我国北京、湖北、广州、陕西、湖南等地和军营都有较大规模的 HAdV7 疫情暴发，造成了严重损失[8-13] 。现阶段没有治疗 HAdV7 感染的有效药物，美国国防部和梯瓦制药联合研发的 4 型和 7 型口服腺病毒活疫苗在预防腺病毒疫情暴发方面显示出很好的效果[14] 。迄今，我国没有相关疫苗上市。目前检测血清中腺病毒中和抗体的方法有两类：一种是细胞病变法，腺病毒与抗体孵育后，观察感染细胞产生的细胞病变效应(CPE)或者检测细胞的活性;另一种则是报告基因法，血清中的中和抗体能够抑制病毒感染从而降低报告基因的表达水平，通过检测报告基因表达被抑制程度来确定中和抗体水平，常用的报告基因有 LacZ、GFP 和萤光素酶基因。传统的 CPE 法周期长(4~8 d)，观察比较主观，灵敏性低，不适于快速准确检测[15] ;而报告基因法可将检测时间缩短至 30 h，方法的重复性好[16] 。本实验中，我们构建了表达萤光素酶的复制缺陷型 Ad7-Luc 重组病毒，建立了基于该重组病毒的 HAdV7 中和抗体检测方法，检测了北京地区 60 例血清中和抗体水平，初步了解 HAdV7 的预存免疫水平。
1 材料与方法
1.1 材料
收集 2017 年 3 月于解放军总医院体检人群的血清样本，血清分装后于-20℃冻存，共 60 份，其中男性和女性各 30 份。另外，选取经 CPE 法验证的 36 份 HAdV7 阳性血清样本用于报告基因法的建立和验证。
HEK-293 细胞、A549 细胞由本实验室保存，两者分别用含 10%胎牛血清、100 μg/mL 链霉素和 100 U/mL 青霉素的 DMEM 和 1640 培养液，于 37℃、5% CO2 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 培 养 ;HAdV7- GZ08(GenBank No.GQ478341)毒株由本室保存;大肠杆菌 Trans1-T1 感受态细胞购自全式金生物有限公司;大肠杆菌 BJ5183 感受态细胞由本室自备;胎牛血清、DMEM 和 1640 培养液、青/链霉素、 Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit、 Tubfect 转染试剂、质粒大提试剂盒均购自赛默飞世 尔 科 技(中 国)有 限 公 司 ;Gibson Assembly Cloning Kit，限制性内切酶 FspⅠ、AsiSⅠ、EcoRⅠ- HF、AatⅡ 、BsiWⅠ 和 T4 DNA 连 接 酶 体 系 购 自 NEB 公 司 ;2 × EX Taq Mix、Pyrobest PCR 体 系 、 DNA marker、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒和 DNA 片段回收试剂盒均购自 TaKaRa 公司;萤火虫萤光素酶分析试剂和细胞裂解试剂购自 Pro⁃ mega 公 司 ;XenoLight D- Luciferin Potassium salt 购自 Perkin Eimer 公司;引物合成和测序交由上海生物工程有限公司完成。
1.2 Ad7-Luc 重组病毒的制备
首 先 用 Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit 从腺病毒培养液中提取 HAdV7-GZ08 的基因组，以其为模板扩增带有 HAdV7 基因组的左右同源臂片段;以 pAd4-dE3-luc 质粒(实验室前期制备)为模板，利用重叠 PCR 法构建含卡那霉素抗性基因及 pBR322 复制原点的载体区;然后将上述片段用 Gibson Assembly Cloning Kit 的方法体外重组，从而获得同源重组质粒 pAd7-re;接下 来 用 FspⅠ 内 切 酶 线 性 化 的 pAd7- re 片 段 与 HAdV7-GZ08 的基因组通过电转化在 BJ5183 感受态细胞中进行同源重组，从而获得 HAdV7 的空载质粒 pAd7-V0;后续用 EcoRⅠ-HF 内切酶对质粒 E3 区 进 行 部 分 缺 失 和 再 连 接 获 得 pAd7-dE3 质粒;最后用 AatⅡ和 BsiWⅠ内切酶对 E1A 区进行缺失并插入带有 MCMV 启动子的萤光素酶报告基因表达框，最终获得重组 pAd7-Luc 质粒。相关引物序列见表 1。
用 AsiSⅠ内切酶将 pAd7-Luc 质粒线性化，并用 Tubfect 转染试剂将其导入 HEK-293 细胞，培养 3~7 d 直至细胞完全病变，并通过连续传代观察其稳定性，最终获得成熟的病毒颗粒，采用蛋白免疫法检测腺病毒滴度。
1.3 Ad7-Luc 重组病毒的体外和体内实验验证为了验证
Ad7-Luc 重组病毒是否构建成功，首先提取相关重组质粒和病毒基因组进行 PCR 扩增，并将扩增产物测序;其次采用蛋白免疫法检测获得的病毒滴度，用不同感染复数(MOI)的病毒感染 A549 细胞，检测 24 h 后萤光素酶的表达 情 况 ;最 后 ，将 经 过 Source 30Q 纯 化 的 重 组 pAd7-Luc 病毒以 1×107 IFU/只的剂量通过肌肉注射途径感染 BALB/c 小鼠，24 h 后用小动物活体成像仪观察萤光素酶的表达情况。
1.4 报告基因法检测抗 HAdV7 中和抗体的建立与验证
针对 HAdV7 中和抗体的检测参照 5 型腺病毒萤光素酶报告基因检测方法[16] 。将血清于 56℃灭活处理 1 h，并将其按照首孔 1/4 稀释、后续逐步 1/3 稀 释 ，最 终 得 到 1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶ 324、1∶972、1∶2916 共 7 个 稀 释 度 的 血 清 ;将 50 μL 稀释后的血清转移至新的 96 孔细胞培养板中，每个样本设置 2 个复孔，并设置不加血清和病毒的阴性孔，以及加入 50 μL 病毒的阳性孔;每孔加入 50 μL 稀释的 Ad7-Luc 重组病毒液，病毒最终含量为 2×104 IFU/孔，混匀后 37℃孵育 1 h;将 A549 细胞用含 2%胎牛血清的 DMEM 培养液稀释 至 2 × 105 /mL，每 孔 加 入 100 μL，于 37℃ 、5% CO2的细胞培养箱中培养 24 h;最后将细胞裂解，用萤光素酶分析检测试剂盒检测其表达水平。
中和抗体滴度以阳性对照的萤光素酶表达为参照，将在血清稀释度中病毒萤光素酶表达抑制达到 90%(IC90)时认定为该血清的中和抗体值，用 GraphPad Prism 软件中的四参数非线性回归进行计算。
为了进一步验证报告基因法的可靠性，采用传统的 CPE 法进行对比分析，观察 2 种方法的一致性。将滴度为 2000 TCID50/mL 的野生型 7 型腺病毒与不同稀释度的阳性血清样本相互作用 1 h，用含 2%胎牛血清的 1640 培养基将细胞稀释至 2.5×105 /mL，每孔加入 100 μL，培养至阳性对照孔完全病变后，每孔加入 20 μL MTS 溶液，37℃孵育 2 h，读取 D490nm 值;最后，将 CPE 法获得的中和抗体滴度与报告基因法进行一致性分析。此外，还对不同血清含量的培养基浓度，以及批间、批内检测结果的一致性进行验证分析。
1.5 统计学处理
采用 SPSS 19.0 软件进行数据分析。采用单因素方差分析比较不同条件下测量的中和抗体滴度，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ad7-Luc 重组病毒的制备与验证
已建立的检测 5 型腺病毒中和抗体的萤光素酶报告基因法广泛应用于流行病学调查和相关 5 型腺病毒载体疫苗的评价工作[17- 18] 。基于此方法，本研究中我们通过同源重组，在 HAdV7 基因组 中 缺 失 E1A 区 并 插 入 萤 光 素 酶 基 因 而 获 得 pAd7-Luc 质粒，具体流程如图 1。所有片段在构建过程中都进行了测序分析(相关引物序列见表 1)，最终将构建的质粒经过包装获得成熟的复制缺 陷 型 Ad7- Luc 重 组 病 毒 颗 粒 ，病 毒 滴 度 可 达 4.85×108 IFU/mL。
提取 pAd7-V0 和 pAd7-Luc 质粒，以及 HAdV7 和 Ad7-Luc 重组病毒基因组，进行 PCR 扩增，测序结果证明萤光素酶片段的大小、序列及插入位点与预期一致(图 2A)。以不同 MOI 的 Ad7-Luc 重组 病 毒 感 染 A549 细 胞 ，检 测 到 的 荧 光 值 不 同 ， MOI 越高则荧光值越高(图 2B);以 MOI=1 感染， 24 h 后 其 荧 光 值 约 为 8×105 。 为 了 进 一 步 验 证 Ad7-Luc 重组病毒是否构建成功，将纯化的 Ad7- Luc 重组病毒以 1×107 IFU/只的剂量通过肌肉注射途径感染 BLB/c 小鼠，24 h 后通过小动物活体成像仪观察荧光表达情况，Ad7-Luc 重组病毒注射部位可以检测到明显的荧光，对照组未检测到荧光，单位时间和体积内荧光表达强度统计结果具有显著性差异(Mann-Whitney 检验，P=0.0079)(图 2C)。
2.2 基于 Ad7-Luc 重组病毒中和抗体检测方法的建立与验证
检测不同数量的 A549 细胞感染不同稀释度病 毒 24 h 后 的 荧 光 值 ，结 果 如 图 3A，MOI 为 0.0625~1 时，荧光值与 MOI 具有较好的线性关系; MOI<0.016 时，平行孔间荧光值偏差较大。选择 MOI 为 0.016~1 进行后续中和抗体检测方法学研究。以 MOI=0.25、0.50、0.75 和 1.00 的病毒剂量，检测 10 份 HAdV7 阳性血清的中和抗体值，结果如图 3B，中和抗体检测结果稳定，4 组间抗体值无统计学差异(One-Way ANOVA 检验，n=10，P> 0.05)。参考 HAdV5 中和抗体检测病毒滴度，实验最终选择 MOI=0.75 用于中和抗体检测。采用传统 CPE 法检测中和抗体滴度，2 种方法的统计分析显示了很好的一致性(R=0.8612，P<0.0001)(图 3C)。此外，为了进一步验证结果的可靠性，我们还对细胞培养基血清含量的影响进行考察，发现组间没有明显差异(图 3D)。为了进一步验证报告基因法检测 HAdv7 中和抗体的稳定性，我们选择阳性血清样本对批间和批内差异进行分析，结果显示该方法可将批间差异控制在 20%以内，批间差异控制在 10%以内(图 3E、F)，说明方法稳定，重复性好。
2.3 北京地区人群 7 型腺病毒中和抗体阳性率
基于建立的报告基因检测方法，我们于 2017 年 3 月收集了北京地区共计 60 份血清样本，男女各占 50%，分别进行了针对 7 型腺病毒和 5 型腺病毒中和抗体水平的检测，将中和抗体滴度按照 <12、12~200、201~1000 和>1000 依次定义为阴性、低滴度、中滴度和高滴度。结果显示北京地区针对 7 型腺病毒的血清阳性率为 60%(36/60)，明显低于对应针对 5 型腺病毒的血清阳性率 75%(45/ 60)，并且该人群 7 型腺病毒的中和抗体水平多集中 在 12~200(低 滴 度)范 围 内 ，占 总 人 群 的 45% (图 4A、B)。图 4C 所示该人群中 7 型腺病毒中和抗体滴度明显低于 Ad5(Mann-Whitney 检验，P=0.0026);此外进一步对人群中男女性别间中和抗体水平进行统计分析，结果显示 7 型腺病毒的中和抗体水平并不存在性别间的差异(Mann-Whit⁃ ney 检验，P=0.5828)(图 4D)。
3 讨论
自 1953 年 HAdV 首次被发现分离以来，陆续鉴定和分离的 HAdV 已有 79 种。4 型和 7 型腺病毒引起的急性呼吸系统疾病一直是美军几十年来重点监测的类型，近年来在美国、中国、意大利、印度、韩国等国家腺病毒引起的呼吸系统疾病检出率和病例呈上涨趋势[2-3,14] 。HAdV7 作为造成我国腺病毒感染的主要血清型，近年来在我国多地和军营都有较大规模的暴发[8-13] 。
国内针对 7 型腺病毒中和抗体的流行病学调查统计报道最早可追溯到 20 世纪 90 年代，赵锦铭等于 1995 年调查北京、南京、成都和海口的人群腺病毒中和抗体情况，结果显示 HAdV7 总的血清阳性率约 22.2%，北京最高(33.5%)，海口最低(5.1%);1999 年成都地区人群腺病毒中和抗体调查结果显示 HAdV7 血清阳性率约为 15.4%[19- 20] 。然而自 2000 年以来，国内并未有新的有关 7 型腺病毒中和抗体的调查报告，一个重要的原因就是检测方法的限制。传统检测方法主要依据其引起的细胞病变去判断，具有主观性，同时还存在周期长(4~8 d)、稳定性差、灵敏度低等不足之处。而报告基因法中，萤光素酶活性检测比 LacZ 和 GFP 等报告基因检测更敏感，操作方法也更为简便快捷，并且所需靶细胞更少，使其适于大规模样品的流行病学调查研究[15-16,21] 。
我们基于 5 型腺病毒中和抗体萤光素酶报告基因法，通过同源重组方法构建复制缺陷型表达萤光素酶报告基因的 Ad7-Luc 重组病毒，并对病毒量、细胞数量及培养基血清浓度等因素逐一验证，获得了最佳的中和抗体检测方法。在实验过程中将该方法与传统的 CPE 检测方法进行比较，二者显示了良好的一致性，并且该报告基因检测方法批间批内实验展现了很好的稳定性和准确度。此方法的建立将检测周期缩短至 1 d，更加适用于大规模血清样本的 HAdV7 快速检测，对了解和研究我国 HAdV7 的血清流行病学提供了非常重要的方法。
基于该萤光素酶报告基因法，我们收集并完成了北京地区 60 份血清样本的 HAdV7 和 HAdV5 中和抗体检测，发现 HAdV7 血清阳性率为 60%，中和抗体滴度多集中在 12~200(低滴度)水平。对比 1995 年和 1999 年相关报道，我们发现近 20 年来北京地区 7 型腺病毒血清阳性率由 33.5%上升到 60%，呈大幅度增长趋势，由此可见 7 型腺病毒引起的感染逐渐增加，须引起足够的重视[22] 。此外，本研究中 60 份血清样本针对 HAdV5 中和抗体阳性率为 75%，抗体滴度大于 200 的样本数占 总 体 的 45% ，与 前 期 报 道(中 和 抗 体 阳 性 率 72% ，抗 体 滴 度 大 于 200 的 样 本 数 占 总 体 的 46.4%)一致[17] 。
研究发现 HAdV7 血清阳性率明显低于 C 亚群的 HAdV5(72%)，显著高于同亚群的 HAdV14 (24.8%)和 HAdV55(22.4%)，其 中 HAdV14 和 HAdV55 中和抗体滴度分别集中在 201~1000(中滴度)和 1>1000(高滴度)水平[3] ，这一研究结果也进一步证实 HAdV7 是 B 亚群中更加易感的潜在血清型，其流行病学调查研究具有非常重要的意义。同时，不同性别间中和抗体水平分析表明在不同性别间 HAdV7 的感染没有明显差异，该结论与 HAdV14 和 HAdV55 相一致。此外，不同年龄段人群中 HAdV7 中和抗体预存免疫水平仍须扩大样本含量做进一步的统计分析。
期刊推荐：《基因组学与应用生物学》Genomics and Applied Biology(双月刊)曾用刊名：广西农业生物科学;广西农业大学学报&广西大学学报(农业与生物科学版);广西农学院学报，1982年创刊，为基因组时代的理论与应用生物学提供服务的科学杂志,将面向基因组学、分子遗传学、生化与分子生物学等基础学科领域，着重刊登农林科学、医药科学、动物科学、环境、生态领域的研究成果。
HAdV7 作为一种潜在的易感腺病毒血清型，其引起的危害须得到进一步关注和重视，基于萤光素酶报告基因中和抗体检测方法的建立，对于了解和掌握我国 HAdV7 预存免疫水平以及相关腺病毒疫苗的研发评价等工作具有重要意义。
