摘要：利用菌丝拮抗反应、酯酶同工酶以及ISSR分子标记对35个金针菇菌株进行多相分类研究，建立了遗传相似性聚类分析图。结果表明：拮抗反应与ISSR分析结果较为一致，而酯酶同工酶与拮抗反应、ISSR分析结果差异较大，ISSR聚类分析结果更为精确。根据ISSR聚类分析，当相似系数为0.86时，可将供试菌株分为7组，其中黄色金针菇的遗传多样性要高于白色金针菇。
关键词：金针菇;菌株;多相分类
金针菇(Flammulinavelutipes(Fr.)Sing.)是我国主栽菇种之一，也是当前我国工厂化生产的重要菇种，深受消费者喜爱。在食用菌生产中，选用优良菌种是实现高产优质的基本前提，目前市场上名目繁多的金针菇品种，部分来自野生菌株系统选育，少数出自单胞杂交，更多的则是利用食用菌具有无性繁殖的特点，通过各种翻版、复制、更名而来，菌种同种异名、异种同名现象严重，给科研、生产带来选材上的困扰。
食用菌的分类主要依据形态、交配亲和性、生化特性以及分子生物学等手段。“多相分类”一词是由COL-WELL[1]提出的，它主要是对微生物的表型、遗传型以及系统发育关系等各个方面可用于鉴别的特征进行研究并加以综合分析。多相分类方法在细菌分类研究中应用较多[2-3]，在大型食用真菌分类鉴定研究中尚鲜见系统报道。该研究通过拮抗反应、酯酶同工酶、ISSR分析结合子实体形态特征对收集的35个金针菇菌株进行了多角度比较分析，以期为金针菇遗传育种、生产应用提供技术参考。
1材料与方法
1.1试验材料
复合PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，麦麸10g，蛋白胨3g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，琼脂20g，水1000mL。
1.2试验方法
1.2.1菌丝拮抗试验参照文献[4]的方法进行。
1.2.2酯酶同工酶参照文献[5]的方法进行。
1.2.3ISSR分析
菌丝体制备：将供试金针菇菌株转接到复合PDA平板培养基上隔膜培养10d后，刮取菌丝置-20℃贮存备用。DNA提取：采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。引物筛选：以菌株W1和Y1作为筛选模板进行ISSR引物筛选，供试引物均购自上海生工生物工程公司。退火温度筛选：以W1为模板，在梯度扩增仪上设置最小温度50.1℃，最大温度58.4℃，自动形成10个梯度，筛选最佳退火温度。
PCR扩增：采用20μL反应体系：1μLDNA模板，1μLPrimer，10μL2×PCRMasterMix(TIANGEN)，8μLddH2O。PCR扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s，相应退火温度退火45s，72℃延伸90s，35次循环;72℃延伸7min;4℃保存。电泳检测：PCR产物在1×TAE缓冲液中用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭在制胶时加入，用分子量MarkerⅢ指示DNA谱带的大小及相对位置，稳压(5V·cm-1)电泳1h后于凝胶成像系统拍照记录。
1.3数据分析
将每个样品的扩增条带按有或无记录，扩增条带存在时赋值为1，不存在时赋值为0，为了消除可能的假阳带，在采集ISSR谱带时，舍弃小于200bp和大于3000bp的DNA非稳定区的谱带。利用NTSYS-pc聚类分析软件对各菌株进行聚类分析，构建35个菌株的聚类分析图。
2结果与分析
2.1金针菇不同菌株间菌丝拮抗反应
根据拮抗试验结果可将供试菌株分为15个菌组，其中包含2个及2个以上菌株的有4组：W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W14、W15、W16、W17为一组(白)，W8、W18为一组(白)，W13、W19为一组(白)，Y1、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y9、Y15为一组(黄)，组内菌株相互之间不拮抗或拮抗反应不明显，说明菌株间亲缘关系很近;而W9、W10、W11、W12、Y2、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y16菌株与其它菌株(组)间均相互拮抗，可认定为有区别性的独立菌株。一般白色菌株与黄色菌株间拮抗反应明显，但菌株Y8表现特殊，与多个白色菌株拮抗不明显，其遗传系谱有待于进一步研究确定。
2.2酯酶同工酶酶谱分析
从酯酶同工酶电泳图谱可以看出，酯酶同工酶图谱获得的条带较多，多态性较丰富。在同工酶谱带中有一个Rf=0.35的共同酶带，是所有金针菇菌株(白、黄)共有的，可以作为金针菇的标志性酶带。在Rf=0.44和Rf=0.40这2条酶带上，白色品种基本都有，而黄色品种除Y11、Y12、Y13这3个菌株外其它菌株基本没有或者比较弱。根据酯酶同工酶谱带的有无，采用相似系数法进行聚类分析，得到树状图。
当相似系数为0.8时，可将供试菌株分为6组。W1、W2、W3、W4、W5、W8、W10、W11、W13、W14、W15、W16、W17、W18、W19、Y11、Y12、Y13为一组，共18个菌株;Y1、Y2、Y3、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y14、Y15为一组，共11个菌株;W6、W7为一组;W9、W12、Y16各自独立为一组。但Y11、Y12、Y13与白色菌株聚为了一大组，其原因有待于进一步深入分析。
2.3ISSR分析
从28个ISSR引物序列中筛选出了10个扩增稳定性强、条带清晰、多态性丰富的引物，对供试的35菌株进行了PCR扩增。10个引物共扩增出79条DNA条带，其中具有多态性带57条，占总带数的72.2%，平均每个引物扩增出7.9条带。根据扩增条带的有无，利用NTSYS-pc聚类分析软件对各菌株进行聚类分析。
当相似系数为0.86时，可将供试菌株分为7组：W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W14、W15、W16、W17为一组，共12个菌株;W9、W10、W12、W13、W18、W19为一组，共6个菌株;Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y15为一组，共9个菌株;Y12、Y13、Y14、Y16为一组，共4个菌株;Y10、Y11为一组，共2个菌株;W11、Y1各自独立为一组。
聚类结果表明，部分菌株之间的相似性非常高，如菌株W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7之间，相似系数为1.00，说明它们之间亲缘关系很近，可能存在同物异名。ISSR聚类分析结果与拮抗反应的吻合度较高，黄色菌株与白色菌株分别优先聚合，未发生混合现象，说明ISSR聚类分析结果更为精确。
3讨论与结论
真菌的拮抗反应是体细胞不亲和的直接体现，是由基因组内异核体不亲和(het)位点控制的，是最常用的食用菌菌种鉴定方法[6-7]。同工酶是基因在代谢水平上的表型，作为一种生化指标，被广泛应用于食用菌种间、种内的分类鉴定[8-9]，ISSR是一种基于微卫星序列发展起来的分子标记，具有简便、稳定、多态性高等优点，已被广泛应用于种质资源鉴定、遗传多样性分析、特异性标记等方面[10-11]。
该研究中拮抗反应与ISSR分析结果的一致性较高，而酯酶同工酶与二者的一致性较差。供试菌株中有3个黄色菌株其酯酶同工酶带型更接近于白色菌株，黄晨阳等[12]、王波等[13]在利用酯酶同工酶研究金针菇菌株的遗传多样性时也发现了个别黄色金针菇的亲缘关系与白色菌株更近。不同菌株酯酶图谱不但在条带的有无上存在差异、还在条带的强弱上存在差异，仅按酶带的有无对菌株进行鉴别存在一定的局限性。
在该试验中，没有发生拮抗线、拮抗沟或隆起等典型拮抗反应的试验组合中，也能观察到菌丝生长形态的明显不同，这说明该供试菌株遗传背景差异还是有的，只是未表现出菌丝间的强烈拮抗，因此拮抗试验只能用于菌株的初步判定。利用ISSR可以实现对不同菌株的区分，其中白色菌株聚为一大组、黄色与浅黄色菌株聚为一大组，说明浅黄色菌株与黄色菌株的亲缘关系更近。综合拮抗反应、酯酶同工酶图谱和ISSR图谱分析表明，供试金针菇菌株遗传多样性较为丰富，其中黄色菌株的遗传多样性要高于白色菌株，多个白色菌株的亲缘关系较近或为同一个菌株，这可能与目前国内使用的白色菌株其来源主要是从日本引进或从日本白色金针菇子实体中分离而来有关。而黄色菌株其来源主要是本地野生驯化、杂交选育或国外引进再加筛选获得的菌株，其来源较为多样化。
参考文献
[1]COLWELLRR.PolyphsictaxonomyofthegenusVibrio：NumericaltaxonomyofVibriocholerae，Vibrioparahaemolytic-us，andrelatedVibriospecies[J].JBacteriol，1970，104：410-433.
[2]李卫民，刘毅，牛天贵，等.分枝杆菌的多相分类鉴定[J].国外医药(抗生素分册)，2007(2)：64-69.
[3]姚竹云，陈文新.多相分类技术在根瘤菌分类中的应用(综述)[J].农业生物技术学报，1998(2)：61-65.
[4]中华人民共和国农业部.NY/T1845-2010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应[S].北京：中国农业出版社，2010.
[5]中华人民共和国农业部.NY/T1097-2006食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法[S].北京：中国农业出版社，2006.
[6]刘盛荣，张维瑞，柯斌榕，等.基于拮抗试验的杏鲍菇菌株分类研究[J].食药用菌，2015，23(1)：33-36.
[7]马瑜，申坚定，宋君锋，等.羊肚菌不同栽培品种间拮抗试验反应[J].中国食用菌，2017，36(5)：80-82.
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