摘要:目的建立扁豆花的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。方法以芦丁为参照物，色谱柱采用LunaC18100A柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脱)，流速为1.0mL/min，检测波长为358nm，柱温为30℃。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.1版本)对扁豆花指纹图谱进行相似度计算。结果以芦丁对照品为参照物，确定了12个共有峰，其相对保留时间的RSD均小于0.33%。10批不同产地扁豆花药材的相似度为0.964～0.997。结论该方法简便可行，精密度、稳定性均良好，可为扁豆花药材的质量控制提供参考。
关键词:扁豆花;高效液相色谱;指纹图谱;质量控制
扁豆花为豆科扁豆属植物扁豆DolichoslablabL.的干燥花，其性味甘、平，归脾、胃、大肠经，具有消暑、化湿、和中的功效，用于暑湿泄泻、痢疾，主产于河南、安徽、浙江等地[1]。其主要含有原花青苷黄酮类、花青素、香豆精[2-3]、芦丁[4]、木犀草素、大波斯菊苷、木犀草素-4'-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、野漆树苷和甘露醇[5]等。目前对扁豆花的质量控制主要是采用定性鉴别和含量测定的方法[4-9]。
中药指纹图谱研究技术更符合中药的特点，在研究中药有效成分、控制中药质量及鉴别方面已日趋完善，且得到了国际广泛认可[10-12]。为了系统、完整地反映扁豆花药材的内在质量，参考了药材指纹图谱的建立方法[13-18]，建立了扁豆花的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.1版本，以下简称评价软件)进行相似度评价，为扁豆花药材的质量控制提供参考。现报道如下。
1仪器与试药
1.1仪器
1260型高效液相色谱仪(DAD检测器，在线脱气机，四元梯度泵，柱温箱，化学工作站，安捷伦公司);MS-105型电子分析天平、AL104型电子天平(MettlerToledo公司)。
1.2试药
芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，纯度为90.2%，批号为100080-201408);水为超纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，扁豆花药材经河南中医药大学代丽萍教授鉴定为豆科扁豆属植物扁豆DolichoslablabL.的干燥花。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:LunaC18100A柱(250mm×4.6mm，5μm);流速:1.0mL/min;检测波长:358nm;柱温:30℃;进样量:10μL;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱。分别吸取溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行分析，在拟订色谱条件下，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上有相应的色谱峰，经二极管阵列检测器纯度测试，二者一致，各色谱峰均达到了基线分离。
2.2溶液制备
称取芦丁对照品，精密称定，用甲醇溶解并制成每1mL含0.1mg的溶液，即得对照品溶液。取药材粉末(过40目筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25mL，称定质量，超声处理30min，取出，放冷，再称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3方法学考察
精密度试验:取同一供试品粉末，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件下连续进样6次，记录色谱图，考察色谱峰相似度的一致性，用指纹图谱软件计算。以7号峰为参照物，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.5%(n=6)，相对峰面积RSD均小于3.0%(n=6)，表明仪器精密度良好。
重复性试验:精密取同一供试品粉末，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，记录色谱图，考察色谱峰相似度的一致性，用指纹图谱软件计算。以7号峰为参照物，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.5%(n=6)，相对峰面积的RSD均小于4.0%(n=6)，表明方法重复性良好。稳定性试验:取同一供试品粉末，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别于0，2，4，6，8，10，12h时进样，记录色谱图，考察色谱峰相似度的一致性，用指纹图谱软件计算。以7号峰为参照物，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.4%(n=6)，相对峰面积的RSD均小于3.0%(n=6)，表明供试品溶液在12h内稳定。
2.4样品测定
分别取10批扁豆花药材样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别测定，记录色谱图。2.5扁豆花指纹图谱分析共有峰确定:根据10批扁豆花样品分析结果，确定了12个共有峰，其中7号峰为芦丁。以芦丁峰为参照，相似度计算及扁豆花对照图谱的生成:采用评价软件中位数法分析，以10批扁豆花生成的共有模式为对照，计算各批样品相似度。
3讨论
提取方法选择:为了最大程度提取扁豆花中的化学成分，试验中考察了甲醇、60%甲醇、95%乙醇的提取效果。结果表明，60%甲醇提取得到的信息最丰富。同时比较了超声和回流提取，结果表明，两者的提取效果差异不明显，从操作简便角度出发，选择了超声提取。检测波长选择:本试验中采用二极管阵列检测器对扁豆花HPLC指纹图谱进行全波长扫描，考察了257，310，358nm波长处的图谱特征。
结果显示，358nm波长条件下，各成分峰峰形较好，峰面积适中，因此设定358nm为检测波长。流动相选择:在色谱条件选择过程中，共比较了乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液和乙腈-1%冰乙酸溶液4种流动相体系，结果显示，不同的流动相体系对峰的分离效果差异较大。甲醇-0.1%磷酸溶液分离效果较差，乙腈-0.1%磷酸溶液分离效果较好，基线平稳，故被选为本试验的流动相。柱温选择:为了保持色谱分析的一致性，设定柱温考察不同试验环境下的色谱分析，分别考察了25，30，35℃3种柱温。结果显示，在30℃下，分离效果较好，故选择30℃作为柱温。
综上所述，通过对10批扁豆花药材的指纹图谱分析，可见各主要色谱峰的相对保留时间基本一致，色谱峰的整体面貌基本一致，但峰面积有差异，说明了其成分含量的差异性。从相似度评价结果来看，相似度均大于0.9，说明地域差异不明显。本研究中建立了扁豆花药材的HPLC指纹图谱分析方法，为扁豆花药材质量的客观评价提供了参考。
参考文献:
[1]河南省食品药品监督管理局.河南省中药饮片炮制规范(2005年版)[M].郑州:河南人民出版社，2005:382.
[2]国家中医药管理局.中华本草(第四册)[M].上海:上海科学技术出版社，1999:458-461.
[3]南京中医药大学.中药大辞典(下册)[M].上海:上海科学技术出版社，2006:2439.
[4]李正国，刘桂银，常虹.白扁豆花中芦丁含量测定方法的研究[J].中国药事，2013，27(3):308-311.
[5]梁侨丽，丁林生.扁豆花化学成分研究[J].中国药科大学学报，1996，27(4):205-207.
[6]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一九七七年版)[M].北京:人民卫生出版社，1978:444.
[7]徐魁，李正国，卞艳晶.白扁豆花药材鉴别方法的研究[J].齐鲁药事，2012，31(10):581-582.
相关刊物推荐：《中国药事》杂志是经国家科委批准，向国内外公开发行的全国科技综合类期刊。主管部门是国家食品药品监督管理局，主办单位是中国药品生物制品检定所。创刊于1987年，至今已有20多年的历史，在药学领域具有广泛而深远的影响。
