【关键词】 血管生成素?2 食管肿瘤 血管形成 免疫组织化学
【Abstract】 Objective To investigate the expression of angiopoietin?2 (Ang?2) in human squamous carcinoma of esophagus and determine it‘s relationship with pathological grades, infiltration and metastasis factors. Methods S?P immunochemical method was performed to detect the expression of Ang?2 in esophagus tissues from 54 cases with squamous carcinoma of esophagus and 22 normal persons. The pathological grades, infiltration and metastasis factors were statistically analyzed. Results Of 54 cases with squamous carcinoma of esophagus, 37 cases had positive expression of Ang?2, with positive rate of 67.06%, which was significantly higher than that in normal esophagus (P<0.05). The expression rate of Ang?2 increased significantly with the increase of pathological grading and lymphatic metastasis (P<0.05). Conclusions The expression of Ang?2 may be positively related to clinical stages and pathological grades in squamous carcinoma of esophagus, indicating that Ang?2 may be involved in the neovascularization of carcinoma and in the occurrence and progression of squamous carcinoma of esophagus and hence can be a useful biological predictor of progression in esophageal carcinoma.
【Key words】 Angiopoietin?2; Squamous carcinoma of esophagus; Angiogenesis; Immunohistochemistry
血管生成素?2(Angiopoietin?2，Ang?2)作为血管生成素家族(Angiopoietins,Angs)重要成员之一，在肿瘤血管生成中发挥调节作用。我们采用免疫组织化学方法对食管鳞癌组织标本中的Ang?2进行检测,旨在探讨其与食管鳞癌病理分级及浸润、转移之间的关系。
1 资料和方法
1.1 临床资料
收集我院2005年10月至2006年3月行电子胃镜检查发现的原发性食管鳞状细胞癌患者85例，其中男63例，女22例;年龄41～76岁，平均59.0岁。病理分级采用常用3级分级法[1]，其中Ⅰ级50例、 Ⅱ级27例、Ⅲ级8例。另选22例正常食管组织标本作对照。所有标本经10%甲醛溶液固定后常规石蜡包埋，制备成5 μm厚的连续切片，用于免疫组织化学染色，并做常规苏木精?伊红染色，病理证实诊断。患者病理组织活检及术前均未接受任何放疗或化疗。
1.2 主要试剂和方法
羊抗人Ang?2(N?18)多克隆抗体为Santa Cruz公司产品，工作浓度1∶100。S?P免疫染色试剂盒购自北京中山生物公司。实验方法：经10%甲醛固定标本，石蜡包埋后切片，一抗为1∶100 Ang?2多克隆抗体，二抗为生物素标记兔抗山羊IgG，三抗为ABC复合物，DAB液显色，苏木精复染，以PBS缓冲液代替一抗作空白对照，用已知的大肠癌阳性片作为阳性对照。
1.3 结果判断标准
采用Ang?2阳性染色强度结合阳性细胞所占百分比作为判断标准。在400倍显微镜视野下每张切片随机观察4个视野，将切片中平均阳性细胞比例及染色深浅分别记0～3分。切片中无阳性细胞为0分，阳性细胞<25%为1分，阳性细胞25%～50%为2分，阳性细胞>50%为3分;染色深度以多数细胞为准，无阳性细胞为0分，淡黄色显色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。再按这两项指标的积分相加将结果分为4级：0分为“-”;1～2分为“+”;3～4分为“?”;5～6分为“?”。其中“?”、“?”为强阳性表达。
1.4 统计学处理
用SPSS 10.0统计软件行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ang?2在食管鳞癌组织及正常食管组织中阳性染色结果及分布
在食管癌组织中， Ang?2的阳性表达率为67.06%，阳性染色细胞呈棕黄色颗粒状或线网状染色，分布于胞质及胞膜，部分微小血管也可见Ang?2着色(图1)。在正常食管黏膜组织中Ang?2多为阴性表达，少数为弱阳性表达(表1)。结果示Ang?2的表达在食管癌组织及正常组织之间比较，两者间差异有统计学意义(P<0.05)。提示食管癌组织中Ang?2呈高表达。表1 食管鳞癌组织及正常食管组织中Ang?2表达组织类型
2.2 Ang?2的表达与食管鳞癌病理分级及浸润、转移的关系
Ang?2表达有明显的异质性，强阳性表达的癌细胞常位于浸润前缘或癌组织的边缘，也有少量成纤维细胞和血管内皮细胞等间质细胞表达阳性;正常对照组只有少数呈弱阳性表达。Ang?2在不同病理分级中表达阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且Ang?2表达的阳性率与浸润深度及淋巴结转移相比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示Ang?2阳性表达率随食管癌病理分级上升而升高(表2)。表2 食管鳞癌中Ang?2的表达与肿瘤病理分级及其浸润、转移的关系
3 讨论
肿瘤性血管是一种高度不成熟的血管。它的生成需要依赖于肿瘤组织产生的促血管生成因子的作用，克服维持血管稳定的诸多因素，包括离断血管周细胞、破坏血管生成的微环境及刺激内皮细胞的增生和迁移。在众多的促血管生成因子中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和Angs是现已发现的内皮细胞特异性因子，在控制血管生成过程中起着主导作用。Angs是惟一含受体激动剂及抑制剂的促血管生成因子，编码4种结构相似的蛋白质，包括Ang?1、Ang?2、Ang?3和Ang?4，均能与内皮细胞膜上的酪氨酸激酶?2 (tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains?2，Tie2)特异性结合，作为调节血管稳定的信号，参与生理性及病理性的血管生成[2]。Angs家族中Ang?2基因定位于第8号染色体短臂上(8p23)，相对分子质量接近75 000。
天然的Ang?2是Ang?1拮抗剂，与受体Tie2结合，不能引起后者的磷酸化，从而可作为阻断血管稳定的信号，离断血管内皮细胞与周细胞的结合，引起血管的不稳定，使其更易接受其他促血管生成因子的刺激，在后者的共同作用下，引起肿瘤的血管生成，从而促进肿瘤的生长。目前研究[3-4]认为，Ang?1的表达与肿瘤血管形成的多少关系不大，而Ang?2表达是肿瘤血管新生起始及加强的因素，与肿瘤血管形成数目、临床分期、预后关系密切。Peng等[5]在研究Ang?1和Ang?2在肝细胞癌异位表达中的生物学效应中认为血管生成素基因参与了肝细胞癌生长与演进，但Ang?1基因的表达没有明显增加肿瘤血管生长的作用，而Ang?2能促进肿瘤的血管生成。
Koga等[6]运用免疫组化技术检测Ang?2在胶质瘤中的表达时发现Ang?2不仅表达在血管内皮细胞上，肿瘤细胞亦有表达，高表达的部位位于肿瘤周边的血管生成区。Ang?2在参与肿瘤血管生成中的具体作用机制尚不清楚。陈林莺等[7]在Ang?2对胃癌血管生成的双向效应研究中发现Ang?2对胃癌血管生成具有双向调节作用，即在Ang?2表达上调的情况下VEGF促进血管生成，而Ang?2抑制血管生成则与VEGF的表达无相关性。
本实验结果表明，食管鳞癌组织中Ang?2的表达明显高于正常组织，且食管鳞癌中Ang?2蛋白表达与其病理分级、浸润程度及淋巴结转移密切相关。肿瘤分化越差，Ang?2表达越强。有淋巴结转移的Ang?2阳性率明显高于无淋巴结转移组，这说明Ang?2与肿瘤的侵袭转移关系密切。Ang?2不仅在肿瘤相关血管的内皮细胞中有表达，而且在食管鳞癌组织中亦有表达，表明来源于肿瘤细胞的Ang?2很有可能参与了肿瘤血管的退化及新生血管的成熟。Ang?2在肿瘤组织中表达明显高于正常组织，特别是Ang?2特异表达于肿瘤边缘的血管重建区，参与肿瘤血管新生的起始及延续过程，影响肿瘤生长和转移，并有望成为一种新的抗肿瘤血管新生靶向因子。其表达调控及活性调节的研究是目前阐明肿瘤血管新生机制并进行抗肿瘤血管新生治疗的研究热点及难点，所以这一研究仍有待于进一步深入。
【参考文献】
[1] 阎晓初.食管疾病[M]//史景泉，陈意生.现代外科病理学.北京：人民军医出版社，1998：107.
[2] Li L Y, Barlow K D, Metheny?Barlow L J. Angiopoietins and Tie2 in health and disease[J]. Pediatr Endocrinol Rev,2005,2(3):399-408.
[3] Ahmad S A, Liu W, Jung Y D, et al. The effects of angiopoietin?1 and ?2 on tumor growth and angiogenesis in human colon cancer[J]. Cancer Res,2001,61(4):1255-1259.
[4] Etoh T, Inoue H, Tananka S, et al. Angiopoietin?2 is related to tumor angiogenesis in gastric carcinoma: possible in vivo regulation via induction of proteases[J]. Cancer Res,2001,61(5):2145-2153.
[5] Peng L, Sun J, Wang W D, et al. Biological effect of ectopic expression of angiopoietin?1 and ?2 in hepatocellular carcinoma cell line[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2003,2(1):94-97.
[6] Koga K, Todaka T, Morioka M, et al. Expression of angiopoietin?2 in human glioma cells and its role for angiogenesis[J]. Cancer Res,2001,61(16):6248-6254.
[7] 陈林莺,张声,林建银,等.促血管生成素?2对胃癌血管生成的双向研究[J].中华肿瘤杂志,2004,26(3):161-164.
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