正确认识免疫抑制剂姜黄素逆转胰岛素抵抗上的研究，有关现在的新实验管理上有什么影响及意义呢?文章是有关医学职称方面的论文。
摘要：胰岛素抵抗(IR)及胰岛?茁细胞功能减退是2型糖尿病发病机理的重要环节[9],目前被认为是一个慢性非特异性炎症过程,胰岛素对胰岛素敏感组织作用的缺陷(肝脏、脂肪组织、骨骼肌)会导致慢性、低水平炎症状态的恶化,任何与慢性炎症有关的过程都会削弱胰岛素的作用,作为恶性循环,胰岛素抵抗又会使炎症恶化。
关键词：姜黄素,胰岛素,医学职称论文
1 材料与方法
姜黄(Curcuma longa L.)是常用中药,临床上用于活血、行气、通经、止痛。姜黄素(curcumin)是一种黄色色素,从姜黄中提取得到的主要有效成分。近年来,大量研究发现它具有免疫调节、抗氧化、抗炎及抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等生理和药理作用[1-4]。在实验室资料中姜黄素是良好的免疫调节剂,并有结果提示姜黄素可以抑制宿主抗移植物反应,而且提高受体动物的存活率[5,6]。在实验研究中,炎症又与胰岛素抵抗密切相关[7,8]。炎症被证实是代谢综合征的共同土壤,联想到许多抗炎药物如阿司匹林可以逆转胰岛素抵抗,本文尝试利用姜黄素治疗肥胖合并极度胰岛素抵抗的炎症模型,并对姜黄素逆转胰岛素抵抗的机制作初步探讨。
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1.1 材 料
1.1.1 姜黄素 购于印度亚洲公司(纯度99%)。
1.1.2 动物 Obob雄性小鼠16只,8周龄、空腹体质量(33~38 g),购自南京国家模式动物中心,用含脂肪6.4%的标准饲料饲养,实验前1周纪录小鼠的饲料摄取、空腹血糖、空腹胰岛素水平及体量等。
1.1.3 FAO细胞 购自 The American Type Culture Collection(ATCC)。
1.1.4 试剂 IR、IRS-1、AKT、P85 多克隆抗体由Steven Shoelson实验室(Joslin Diabetes Center, Harvard)提供。FBS TNF?琢、胰岛素购自Sigma, St. Louis USA, I-?资B?琢 抗体,IKK?酌抗体,购于 Santa Cruz, CA, GST-I-?资B(1-54) 底物由Boston Biologicals, Wellesley, MA合成。
1.2 方 法
1.2.1 体外细胞实验 FAO细胞使用培养液 DMEM(购自 Gibco公司),细胞置于37 ℃,5%CO2的培养箱中培养。在10 cm 培养皿用10 mL DMEM+10%FBS含有高浓度葡萄糖(25 mmol/L)的培养液中培养至80%重叠率,经5 mL 0.1%BSA孵育16 h后接受不同浓度(0~40 umol/L)的姜黄素预处理,然后接受鼠TNF?琢 10 nmol/L刺激处理,于20 min后用预冷的PBS终止,并收集细胞,用于制作蛋白匀浆,备用, I-?资B?琢的水平用免疫印迹的灰度表示。NF-?资B的活性用20 min内试验细胞和对照细胞I-?资B?琢灰度差值表示。
1.2.2 动物实验 利用食物参入法制成含2%姜黄素的颗粒饲料(Lab Diets, 5008),低温保存。动物饲养环境为中央通气,层流环境,恒温(23 ℃)、恒湿,12 h明暗光照循环,24 h随意饮食环境. 动物购入后第5天开始接受口服葡萄糖耐量试验,并留取空腹血浆作血浆胰岛素水平,和其它循环因子的检查。在验证空腹血糖和胰岛素水平后动物被随机分成两组,并接受姜黄素治疗,对照组用颗粒饲料5008作为对照。每天记录动物的摄食量,每3周测量空腹血糖并留取空腹血浆1次, 第6周空腹状态下进行第2次口服葡萄糖耐量试验,并留取空腹血浆。试验后继续接受姜黄素治疗,第7周于空腹状态下接受5 U/kg胰岛素富强注射,注射后5 min整,用断颈法迅速处死动物, 留取肝脏经液氮过渡后在-80 ℃低温冰箱保存,作胰岛素信号分析之用。血浆多种循环炎症细胞因子的检查用Linco Research 的Luminex 试剂盒并采用Luminex 200 监测结果。
1.2.3 免疫印迹 细胞或组织裂解液(30 mmol/L Hepes, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 7.4。蛋白酶抑制剂由1 mmol/L PMSF, 3 ?滋mol/L aprotinin, 5 ?滋mol/L pepstatin, 10 ?滋mol/L leupeptin, 25 mmol/L Benzamidin, 2 mmol/L Na-vanadate, 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L Ammonium Molybdate, 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate, 5 mmol/L EGTA)裂解细胞, SDS-聚丙烯酰胺凝胶(6%),蛋白加热变性后每孔加30 ?滋g, 电转移仪将蛋白转到PVDF膜。5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液洗膜,加一抗, 4 ℃孵育过夜,TBS-T缓冲液洗膜,加过氧化物酶标记的IgG 抗体(购自Amersham USA),室温1 h,TBS-T缓冲液洗膜,加ECL 1 min,暗室显影2~3 min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像。
1.2.4 统计学分析 采用t检验。
2 结 果
2. 1 姜黄素抑制NF-?资B的量效和时效关系
Fao细胞在10 cm2 培养皿用10 mL在10% FBS+DMEM含有高浓度葡萄糖的培养液中培养至80%重叠,经5 mL 0.1% BSA孵育16 h后接受姜黄素预处理:剂量关系用梯度浓度如图1所示,时效曲线用30 μmol/L。预处理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激处理,于20 min后用预冷的FBS终止,并收集细胞,用于制作蛋白匀浆。用免疫印迹检测匀浆内I-?资?注?琢的水平。如图1A所示:20 μmol/L姜黄素20 min预处理能够抑制TNF刺激的I?资?注?琢的降解。从姜黄素的时效关系图1B可见,姜黄素有效剂量30 μmol/L对NF-κB的抑制作用在30~60 min时最强。
2. 2 姜黄素以逆转肥胖小鼠的胰岛素抵抗
经过6周姜黄素的治疗,小鼠的空腹血糖水平没有明显下降,但空腹胰岛素的水平下降约30%(图2),口服葡萄糖耐量曲线的水平也明显下降(图2A),曲线下面积的比较有明显差异(P< 0.01)。由空腹血糖和胰岛素水平计算的HOMA指数[用FBS(mmol/L) ×胰岛素(mmol/L)/22.5 计算]也呈明显降低(P< 0.05,图2C),提示小鼠对胰岛素抵抗的水平得到明显改善。
2. 3 姜黄素对循环细胞因子的影响
Obob 小鼠治疗6周后的空腹血浆用Linco Research Luminex 试剂盒同时检测细胞因子IL-1?茁,IL-6 和 TNF?琢的水平。如图3所示:尽管循环胰岛素的水平明显下降,但TNF?琢 [(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL]水平没有明显改变,与之对应,循环中IL-1?茁[(33.9±3.2)pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] 和IL-6 [(72.1±9.8)pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL]水平明显被抑制(P< 0.05)。
2. 4 姜黄素为胰岛素信号的增效剂
经胰岛素刺激的肝脏组织在液氮下作粉碎并以1% Triton X100 RAPA(含有全部蛋白酶抑制剂,和蛋白磷酸酶抑制剂)缓冲液在冰点匀浆。经全速4 ℃离心30 min取上清液(1 mg 蛋白质)作IRS-1和 IR联合免疫沉淀。经上样缓冲液释放的沉淀目标蛋白质经6%的SDS-PAGE 分离,转移到PVDF膜上。用4G10、P85、 AKT抗体作免疫印迹。如图4所示:胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明显升高, 而胰岛素受体的磷酸化水平没有明显改变。与IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明显升高,AKT的磷酸化的水平也明显升高。
3 讨 论
在抗炎药物对胰岛素抵抗有逆转作用的报道之后, 我们探索新的抗炎药物对胰岛素抵抗的治疗作用, 姜黄素是继阿司匹林后又一个具有类似协同作用的活性成分[11]。在姜黄素治疗6周后,尽管治疗组和对照组的体重没有明显改善,但小鼠空腹血糖的水平明显下降,而且胰岛素的水平也明显降低,提示胰岛素的敏感性明显升高,葡萄糖耐量曲线在治疗后也明显改善,说明小鼠整体对葡萄糖的处理能力明显升高,即obob 小鼠的胰岛素抵抗的水平得到明显改善。这些都进一步说明姜黄素治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗。
研究证实NF-?资B是启动和控制炎症的主要核转录因子,在非激活条件下,NF-?资B和胞浆内一种被称为NF-?资B的抑制物(I-?资B)的蛋白质结合处于无功能状态。我们利用胰岛素敏感组织来源的细胞系FAO,验证了姜黄素能够抑制TNF?琢刺激的I?资B?琢的降解,继而抑制NF-?资B的活性, 我们推测在高度肥胖NF-?资B高度激活的肥胖小鼠obob 体内,姜黄素可能具有更加明显的改善代谢的作用。
在NF-?资B激活的模型上我们证实炎症激发的高水平循环细胞因子是系统性胰岛素抵抗的原因。采用细胞因子的中和抗体可以逆转胰岛素抵抗,在NF-?资B抑制型模型,胰岛素敏感性升高,而且循环中细胞因子的水平较低。在肥胖发生过程中,NF-?资B 活性与动物的体重呈正相关。Obob 小鼠的肝脏,脂肪以及淋巴组织中NF-?资B的活性水平升高,循环细胞因子的水平增高,这些都说明炎症介质与胰岛素抵抗的关系。经姜黄素治疗的肥胖动物循环中细胞因子IL-1, IL-6水平均明显下降,由于IL-1和IL-6是NF-?资B活性调控的重要因子,因此,我们认为姜黄素在胞浆内有多个作用靶点,通过对上述细胞因子的抑制作用,影响NF-?资B 的活性,继而达到逆转胰岛素抵抗和改善胰岛素敏感性的作用。在肝脏组织的胰岛素信号检测中,胰岛素刺激的IRS-1 酪氨酸磷酸化的水平明显升高,AKT的活性也明显增强。这些结果都进一步说明肥胖小鼠胰岛素的敏感性在治疗后得到了改善,姜黄素能提高obob小鼠胰岛素的敏感性,姜黄素作为一个免疫调节剂用于抑制免疫排斥的同时,对系统性炎症也有抑制作用,可能是通过抑制NF-?资B来改善胰岛素敏感性的。
