相信大家对深市体外细胞毒性以及颜面赝复体粘接剂等这些信息不是很了解，怎样来充分的认识呢?又该怎样来加强这方面的管理治疗措施呢?本文在此做了相应的介绍。文章选自：《中华实验和临床病毒学杂志》,《中华实验和临床病毒学杂志》为中国科学技术协会主管、中华医学会主办的医学病毒学专业学术期刊，国内外公开发行。该刊为双月刊，主要报道我国医学病毒学的应用及基础理论研究，人类病毒性疾病预防、诊断、流行病及临床治疗等方面的新技术、新方法、新进展、新成果，以及国外在该领域的最新研究进展。
摘要：由于生物材料容易浸出能引起组织反应或炎症反应的物质,这些物质大多是原料单体、小分子聚合物、溶剂等,所以生物材料在应用于人体之前,都必须经过严格的检验,除临床应用所要求的机械及理化性能外,还应具备良好的生物相容性[7]. 国际标准化组织发布了ISO 10993医疗器械生物学评价系列标准中,细胞毒性试验以其简便、快捷、灵敏性高、节省动物等优点被列为首选试验项目.
关键词：体外细胞毒性,医学论文,论文发表
颜面赝复体的固位中组织倒凹和机械固位多用作辅助方式,种植体固位虽然是颜面赝复体首选的固位方式[1],但由于多种原因使患者不能接受种植手术时, 就需依赖粘接固位. 传统的赝复体粘接剂中,聚丙烯酸酯类粘接剂价廉,粘接强度尚可,但皮肤上的粘接剂残留较难去除[2];有机硅类粘接剂粘接强度高,皮肤残留少,但含有机溶剂具有潜在刺激性[3]. 我们通过乳液聚合的方法合成有机硅改性聚丙烯酸酯类的颜面赝复体粘接剂?1(facial prosthesis?skin adhesive?1,FPSA?1),并参照国际标准化组织发布的医疗器械生物学评价标准,进行体外细胞毒性试验[4],将小鼠肺成纤维细胞(L?929)在离体状态下进行培养,以探讨FPSA?1浸提液对L?929细胞生物学活性的影响,评价其生物的相容性.
1材料和方法
1.1材料FPSA?1 (第四军医大学口腔医学院与西北工业大学联合研制);无菌滤纸, 高压蒸汽灭菌后备用. L?929细胞株(第四军医大学基础部免疫学教研室);DMEM培养液(美国Gibco公司);含100 mL/L的标准胎牛血清(FBS,杭州四季青公司);100 kU/L氨苄青霉素、100 kU/L硫酸链霉素, pH=7.2~7.4;胰蛋白酶,四甲基偶氮唑盐(MTT) (美国Sigma公司);四甲基偶氮唑盐溶液,实验前用磷酸盐缓冲液(PBS)新鲜配制, 浓度为5 g/L,过滤除菌后4℃避光保存,1 wk内使用. 二甲基亚砜(DMSO, 北京索莱宝公司); 倒置相差显微镜(日本OLYMPUS TH4?200);超净工作台(AIR TECH,苏净集团安泰公司);CO2培养箱(HERA cell 150, Germany);25 cm2细胞培养瓶,96孔细胞培养板(NUNC,丹麦).
1.2方法
1.2.1浸提液制备将无菌滤纸裁成1 cm×1 cm试样备用, 按每面涂50 μL的粘接剂使滤纸浸渍均匀,清洁空气轻吹2~3 min,待粘接剂由白色乳液变至无色透明胶膜,依照ISO 10993?12样品制备要求[5],试样按表面积与浸提介质比6 cm2/mL加入含100 mL/L FBS的DMEM培养液中,另将未涂粘接剂的无菌滤纸作为阴性对照按同样比例浸于相同培养液,放置在37℃,50 mL/L CO2培养箱内浸提72 h,分别得到1000 mL/L FPSA?1浸提液和阴性对照组浸提液,过滤除菌. 再将1000 mL/L浸提液经DMEM培养液稀释成500,750 mL/L浓度浸提液备用.
1.2.2细胞培养将对数生长期的L?929细胞经2.5 mL/L胰酶消化、吹打分散后计数,用含100 mL/L FBS的DMEM培养液配成浓度为1×107/L的细胞悬液,按每孔100 μL的细胞悬液接种于96孔培养板上,放入37℃,50 mL/L CO2培养箱中. 四周边缘孔不接种细胞,每孔加入100 μL的DMEM培养液,起边缘封闭作用.
1.2.3MTT测试细胞培养24 h后弃去原培养液,用PBS洗涤2次,进行培养液交换,按每孔200 μL分别加入500,750 mL/L的FPSA?1浸提液,另设阴性和阳性对照组,分别加入等量无菌滤纸浸提液和含6.4 mL/L苯酚的培养液,每组重复6孔,常规培养,每日在倒置显微镜下观察细胞形态及增殖情况. 分别于加样后2,4,7 d取出96孔板,在受试孔中每孔加入20 μL的MTT溶液,37℃,50 mL/L CO2培养箱中保温4 h后弃去旧液,每孔加入150 μL的DMSO,振荡10 min,在多道扫描酶标仪上测A490 nm值,计算细胞的相对增殖率(RGR). RGR(%)=(实验组A490 nm/阴性对照组A490 nm)×100%,细胞毒性分级按如下标准[6]评价: RGR≥100为0级;80~99为1级;50~79为2级;30~49为3级;0~29为4级.
统计学处理:用SPSS12.0统计分析软件,对数据采用方差分析和Tukey多重比较检验 (α=0.05).
2结果
2.1MTT测定加样后2,4,7 d,阳性对照组与其余各组的A值之间均有显着性差异(P<0.01), 500 mL/L和750 mL/L FPSA?1浸提液组之间A490 nm差异无统计学意义(P>0.05,表1);在各时相500 mL/L和750 mL/L FPSA?1浸提液组的RGR均大于80%,参照标准评分FPSA?1的细胞毒性为1级,各组细胞RGR及毒性评级结果见表2.
表1FPSA?1与对照组的A490 nm值(略)
bP<0.01 vs 阴性对照, 500 mL/L FPSA?1,750 mL/L FPSA?1. FPSA?1: 颜面赝复体粘接剂?1.
表2FPSA?1与对照组的RGR及细胞毒性等级(略)
bP<0.01 vs 阴性对照,500 mL/L FPSA?1,750 mL/L FPSA?1. FPSA?1: 颜面赝复体粘接剂?1.
2.2倒置显微镜观察细胞生长情况加样后2,4,7 d,在倒置显微镜下观察细胞生长情况,阴性对照组L?929细胞形态正常,呈梭形,细胞突充分伸展,随着时间延长,细胞数量增加(图1A);500 mL/L FPSA?1浸提液组细胞形态正常,生长良好,750 mL/L FPSA?1浸提液组局部可见少量细胞出现溶解或坏死(图1B,C);阳性对照组细胞数量明显减少,大量细胞出现固缩、坏死、崩解(图1D).
3讨论
MTT法应用材料浸提液检测其细胞毒性,对受试材料溶出物的毒性检测敏感性较高,也比较符合动物体内的毒性实验结果,是一种较好的体外评价生物材料细胞毒性的研究方法[8]. L?929细胞具有传代稳定、繁殖迅速、体外培养条件低、能为许多材料细胞毒性所共用等优点,成为细胞毒性试验中应用最早且使用最广泛的细胞.
A: 阴性对照组; B: 50 mL/L FPSA?1浸提液组; C: 750 mL/L FPSA?1浸提液组; D: 阳性对照组.
图1倒置显微镜观察加样后7 d各组L?929细胞形态学变化×100(略)
我们采用500 mL/L和750 mL/L FPSA?1浸提液进行MTT实验,以检测细胞毒性是否与材料溶出物有关,以及溶出物浓度与细胞毒性的剂量依赖关系,可以比较全面地评价FPSA?1的细胞毒性. 经500 mL/L和750 mL/L FPSA?1浸提液培养的L?929细胞,在加样2,4和7 d后,细胞RGR均在80%以上,细胞毒性为1级,各浓度浸提液组之间RGR无显着差异,提示L?929细胞增殖与FPSA?1浸提液的浓度无明显相关,符合生物材料的医用标准. 与阴性对照组相比,750 mL/L FPSA?1浸提液组局部出现少量细胞溶解或坏死,这可能是由于在细胞毒性试验中,通常随着浸提液浓度的增加,细胞毒性也会相应增加的缘故[9].
FPSA?1为有机硅改性的聚丙烯酸酯类粘接剂,是用含双键的有机硅单体与丙烯酸酯单体,通过自由基引发的乳液聚合反应合成的. 在聚合反应过程中加入了离子型和非离子型的乳化剂,其中离子型乳化剂在制备粘接剂浸提液时可促进胶膜吸水溶解,使得粘接剂胶膜中残留的丙烯酸酯单体或其它助剂析出,从而表现出轻微的细胞毒性. 我们的结果提示在粘接剂合成过程中应尽量提高共聚单体功能团的交联程度即提高单体转化率,或采取相应措施以减少粘接剂中的单体残留,同时还应提高颜面赝复体粘接剂的耐水性能. 这一方面可通过提高聚合物中有机硅的含量来实现,另一方面可以在乳液聚合反应中使用反应型乳化剂以减少离子型乳化剂的使用量. 反应型乳化剂在乳化剂分子中含有能发生自由基聚合反应的双键,在反应时参与单体共聚,不以游离聚合物粒子形式存在,从而改善粘接剂的性能[5,8].
综上所述,本研究采用MTT法评价细胞毒性,其结果显示FPSA?1无明显的细胞毒性,具有良好的细胞相容性,是一种具有发展前景的颜面赝复体粘接材料.
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